Benz (a) piren: njegove lastnosti, rakotvorni učinek, metode za njegovo določanje. Metoda za izvajanje meritev masnega deleža benzo (a) pirena v živilih, živilskih surovinah, aditivih za živila s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti Določanje


stran 1



stran 2



stran 3



stran 4



stran 5



stran 6



stran 7



stran 8



stran 9



stran 10



stran 11



stran 12



stran 13



stran 14



stran 15



stran 16



stran 17



stran 18



stran 19

GOST 24104.

Rotacijski uparjalnik IR-1M.

GOST 25336.

Kopalna voda.

Magnetno mešalo tipa MM-ZM z električnim gretjem.

Kromatoskopski ultravijolični osvetljevalec s spektralnim območjem 250 - 700 nm in žarnico BUV-15 kot vir UV sevanja.

Kromatografska steklena komora 40 x 40 x 40 cm.

Steklene plošče za tankoplastno kromatografijo 5 x 20 in 20 x 20 cm.

Steklena kromatografska kolona dolžine 500 mm in premera 20 mm z izvlečenim koncem na dnu in rezervoarjem s prostornino 50 - 60 cm 3 ПШ 14/23.

Hladilnik ХПТ-2-400-29/32 ХС ali ХШ-1-400-29/32 ХС po GOST 25336.

Alonge tipa AIO-14/23-50 TS ali AIO-14/23-14/23-65 TS po GOST 25336.

Merilno ravnilo z delitvijo lestvice 0,1 cm po GOST 427.

Deflegmator 250-19 / 26-29 / 32 TS ali 300-19 / 26-29 / 32 po GOST 25336.

Šoba P-1-19/26-14/23-14/23 TC ali H-2-19/26-14/23 TC po GOST 25336.

GOST 25336.

GOST 25336. Dimenzionalni cilindri 1-100, 1-250 ali 3-100, 3-250 po GOST 25336.

Kemično steklo V-1-100 ali V-1-150 po GOST 25336.

Bučke K-1-100-29/32 THS, K-1-25R-29/32 THS, K-1-500-29/32 THS ali P-1-500-29/32 THS po GOST 25336.

Buechnerjev lijak 1 ali 2 ali 3 po GOST 9147.

Skodelice za tehtanje (vrečke za steklenice) SV-14/8 ali SV-19/9, ali SV-24/10, ali SV-34/12 po GOST 25336.

Mikrobrizgalke tipa MSH-10, steklene kapilare.

Univerzalni papirni indikator.

Laboratorijski filtrirni papir po GOST 12026.

Skalpel ali tanka lopatica.

Rektificirani etilni alkohol po GOST R 51652 ali tehnični rektificirani etilni alkohol po GOST 18300.

Acetonitril v skladu z normativnim dokumentom.

Celulozni mikrokristalni prah v skladu z normativnim dokumentom.

GOST R 51650-2000

Benz (v) krizen, vsebnost glavne snovi ni manjša od 98%.

Sephadex LH-20.

Silikagel znamke ASKG v skladu z normativnim dokumentom.

Dovoljena je uporaba drugih merilnih instrumentov z meroslovnimi lastnostmi in opreme z njimi Tehnične specifikacije, kot tudi reagenti in materiali v kakovosti, ki ni nižja od zgoraj navedenega.

5.2 Priprava na test

5.2.1 Priprava topil

Topila (n.heksan, etilni alkohol, aceton, benzen) destiliramo na običajen način s povratnim kondenzatorjem.

Dimetilformamid destiliramo tako, da v destilacijsko bučko dodamo 120 cm 3 benzena in 36 cm 3 vode na 1 dm 3 topila.

5.2.2 Priprava celuloznega acetata

(50,0 ± 2,0) g mikrokristalne celuloze damo v bučko z ravnim dnom s prostornino 500 cm 3, pripravimo zmes 150 cm 3 benzena ali toluena, 70 cm 3 anhidrida ocetne kisline in 0,3 cm 3 žveplove kisline. v ločeni bučki se doda. Reakcijsko zmes mešamo z magnetnim mešalom 6-8 h, pustimo brez mešanja nadaljnjih 18 h, nakar tekočo fazo odlijemo in preostanek vlijemo v 300 cm3 etilni alkohol mešamo, pustimo v alkoholu 24 ur, nato celulozo odfiltriramo na Buechnerjevem liju, speremo s 100 cm 3 etilnega alkohola in destilirano vodo, dokler ni izpiralna voda nevtralna (glede na indikatorski papir).

Nato preverite kromatografsko aktivnost acetilirane celuloze. Da bi to naredili, 3-4 ure pred analizo pripravite mešanico etilnega alkohola, acetona in vode, vzetih v volumskem razmerju 60:25:15, in jo vlijte v kromatografsko komoro, obloženo s trakovi filtrirnega papirja. Višina plasti topila mora biti 1,5–2 cm kapilara do točke 5 μl raztopine benz (a) pirena z masno koncentracijo 1 μg / cm 3. Ploščo postavimo v kromatografsko komoro in pustimo v komori, dokler se nivo topila ne dvigne za najmanj 100 mm od začetne črte. Na koncu kromatografije ploščo odstranimo, posušimo na zraku in pod žarnico ultravijoličnega obsevalnika opazimo fluorescentno modro liso benzo(a)pirena. Izmerite razdaljo od začetne črte do fronte topila in do sredine pege benzo(a)pirena; izračunajte vrednost Rj, ki oceni hitrost gibanja benzo(a)pirena na plošči, po formuli:

kjer je XBP razdalja od začetne črte do sredine pege benzo(a)pirena, mm;

L je razdalja od začetne črte do fronte topila, mm.

Vrednost Rj benzo(a)pirena mora biti 0,1.

Za pripravo delovne plošče 5 g acetilirane celuloze suspendiramo v 20 cm 3 etilnega alkohola in zlijemo v enakomernem sloju na ploščo 20x20 cm.

5.2.3 Priprava standardnih raztopin benzo(a)pirena in benzo(b)krizena

(10,0+0,2) mg benzo(a)pirena in benzo(b)krizena odtehtamo v tehtnice (vreče za steklenice). Vzorce kvantitativno prenesemo v merilne bučke s prostornino 100 cm 3: benz(a)piren-benzen, benzo(c)krizen-acetonitril, nato raztopino benz(a)pirena dopolnimo z benzenom do oznake, prostornina raztopine je benz(c)krizen-acetonitril. Dobljene raztopine imajo masno koncentracijo 100 μg/cm 3 . Raztopine shranjujemo na hladnem temnem mestu največ tri mesece.

5.2.4 Priprava delovnih raztopin benzo(a)pirena in benzo(b)krizena

Delovne raztopine pripravimo tako, da standardne raztopine razredčimo s pipetami s prostornino 1, 5 in 10 cm 3 in merilnimi bučkami s prostornino 100 cm 3, raztopino dopolnimo z ustreznim topilom do oznake, premešamo in shranimo. v temnem hladnem prostoru ne več kot en mesec.

Priprava raztopine benzo(a)pirena z masno koncentracijo 1,0 μg/cm 3 (določeno s spektrofluorimetrijo): 1,0 cm 3 odvzamemo iz standardne raztopine in prenesemo v merilno bučko s prostornino 100 cm 3 ; Volumen raztopine naravnamo na oznako z benzenom.

Priprava raztopine benz(a)pirena z masno koncentracijo 0,25: 1,0 in 5,0 μg/cm 3 (določi se s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti): 0,25 se vzame iz standardne raztopine; 1,0; 5,0 cm 3 in prenesemo v merilne bučke s prostornino 100 cm 3; volumen raztopin naravnamo na oznako z acetonitrilom.

Priprava raztopin benzo(b)krizena z masno koncentracijo 0,5 in 10 μg/cm 3 : iz standardne raztopine odvzamemo 0,5 oziroma 10 cm 3 in prenesemo v merilne bučke s prostornino 100 cm 3; Volumen vsake raztopine smo dopolnili do oznake z acetonitrilom.

5.2.5 Priprava raztopin za umerjanje

Za pripravo umeritvenih raztopin zmesi benzo (a) pirena in benzo (b) krizena, prostornine standardne raztopine benzo (a) pirena z masno koncentracijo 100 μg / cm 3 in delovne raztopine benzo (b ) masno koncentracijo krizena 10 μg/cm 3, z acetonitrilom dopolnite volumen do oznake. Dobljene raztopine zmešamo in shranimo v temnem hladnem prostoru največ en mesec.

tabela 2

rešitev

Prostornina začetne raztopine, cm3

Masna koncentracija v raztopini za umerjanje, µg/cm3

Masna koncentracija benz (a) pirena 100 μg / cm 3

Benz (v) masna koncentracija krizena 10 μg / cm 3

Benz(a)piren

Benz(v)krizen

5.3 Izvedba testa

5.3.1 Ločevanje benzo(a)pirena iz produkta

V bučko z okroglim dnom ali bučko z ravnim dnom s prostornino 100 cm 3 damo vzorec produkta, ki tehta 10 g, raztopino, sestavljeno iz 4 g kalijevega hidroksida v 50 cm 3 92% etilnega alkohola. dodano. Vsebino bučke premešamo s stresanjem. Bučko priključimo na povratni kondenzator in segrevamo na vodni kopeli ali na magnetnem mešalu z reakcijsko mešanico, ki vre 3 ure.Nato v bučko skozi hladilnik dodamo 100 cm3 destilirane vode. Reakcijsko maso ohladimo na sobna temperatura. Po ohlajanju reakcijsko maso prenesemo v lij ločnik s prostornino 500 cm 3 . Če po hidrolizi v reakcijski masi ostane trden ostanek, ga ločimo na Buchnerjevem liju, pri čemer ostanek na filtru speremo s 30 cm 3 vročega etilnega alkohola. Tekoča faza reakcijske mase se uporabi za ekstrakcijo. V lij ločnik dodamo 30 cm 3 n.heksana. Vsebino lijaka pretresemo in pustimo, da se tekočine ločijo. V primeru tvorbe emulzije dodamo mešanici v liju ločniku 20 cm 3 etilnega alkohola. Po ločitvi spodnjo vodno-alkoholno fazo prelijemo v bučko, heksanski ekstrakt pa v drugi lij ločnik. To obdelavo reakcijske mase izvedemo še dvakrat, pri čemer uporabimo 30 cm3 n-heksana za ekstrakcijo in etilnega alkohola za ločevanje emulzije v obrokih po 20 cm3.

Po končani ekstrakciji kombinirani heksanski ekstrakt speremo v liju ločniku z destilirano vodo trikrat po 30 cm 3, ekstrakt prenesemo v bučko z okroglim dnom s prostornino 100 cm 3 in filtriramo skozi plast brezvodnega natrijevega sulfata na lijaku s poroznim filtrom. Raztopino uparimo na rotacijskem uparjalniku do prostornine 50 cm 3 pri temperaturi vodne kopeli, ki ne presega 60 °C.

En odvzeti ekstrakt prenesemo v lij ločnik s prostornino 500 cm 3 in mu dodamo 50 cm 3 mešanice dimetilformamida in vode v volumskem razmerju 9:1. Zmes močno stresamo 1 minuto, po ločitvi faz spodnjo prelijemo v bučko z ravnim dnom s prostornino 200 cm 3 in iz zgornjega heksana ponovno ekstrahiramo 50 cm 3 zmesi dimetilformamida in vode. plast. Heksansko plast zavržemo, ekstrakt dimetilformamida, združen v bučko z ravnim dnom, prenesemo v lij ločnik, dodamo 100 cm 3 destilirane vode in izvedemo ekstrakcijo iz vodne faze s heksanom trikrat po 50 cm 3. Vodno fazo zavržemo, heksanski ekstrakt pa trikrat speremo z vodo po 30 cm 3, prenesemo v bučko z ravnim dnom, dodamo 10 g brezvodnega natrijevega sulfata in inkubiramo eno uro, n.heksan odparimo na rot. uparjalnik do prostornine 1,5 - 2,0 cm 3, preostalo topilo odstranimo

GOST R 51650-2000

zračni tok skozi vakuumsko alongo, povezano z vodno črpalko, ostanek v bučki raztopimo v 0,5 cm 3 etilnega alkohola.

V kozarec s prostornino 100 cm 3 odtehtamo (2,5 ± 0,2) g Sephadex LH-20, dodamo 20 cm 3 etilnega alkohola in pustimo nabrekati 3-4 ure.Nato gel prenesemo, speremo z majhno količino alkohola v stekleno kromatografsko kolono, pustite, da topilo odteče tako, da ostane plast alkohola nad plastjo sorbenta najmanj 2 mm. Preostanek ekstrakta iz bučke s pipeto nanesemo na pripravljeno kolono in ga trikrat izperemo iz bučke z etilnim alkoholom po 0,5 cm 3 . Eluiranje iz kolone policikličnih aromatskih ogljikovodikov, vključno z benzo(a)pirenom, izvedemo s 40 cm 3 etanola, prvo frakcijo 12 cm 3 zavržemo, drugo frakcijo 25 cm 3 zberemo. Hitrost eluiranja topila 0,5 cc/min se doseže z rahlim nadtlakom s tokom zraka ali dušika skozi šobo, povezano s puhalom ali plinsko jeklenko. Plin je treba dovajati skozi stekleno cev, napolnjeno s silikagelom.

Kolona s Sephadex LH-20 se lahko uporablja večkrat. Da bi to naredili, preprečimo izsušitev sorbenta po frakcioniranju, kolono speremo s 25 cm 3 etilnega alkohola in dodamo naslednji vzorec.

Raztopino druge frakcije prenesemo v hruškasto bučko s prostornino 50 cm 3, topilo uparimo do volumna 0,5 - 1,0 cm 3, njegov ostanek odstranimo v toku zraka ali dušika.

Dobljeno frakcijo, ki vsebuje benzo(a)piren, nadalje analiziramo s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti ali spektrofluorimetrično metodo.

Hkrati se izvede kontrolni poskus, pri katerem se izvedejo vse faze analize z uporabo reagentov po postopku, vendar brez tehtanja izdelka.

5.3.2 Določanje benz(a)pirena s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti

5.3.2.1 Pogoji kromatografije

Pogoji kromatografije so izbrani glede na vrsto uporabljenega tekočinskega kromatografa in kromatografske kolone.

Kot primer lahko navedemo naslednje pogoje za kromatografsko določanje benzo(a)pirena.

Tekočinski kromatograf AIex-334 s fluorescentnim detektorjem Kratos FS-970.

Kolona Supelcosil LC-PAM, granulacija 5 mikronov, dolžina 150 mm, premer - 4,6 mm.

Fluorometrični detektor: valovna dolžina vzbujanja 300 nm, emisijski filter - 418 nm.

Mobilna faza: acetonitril in voda v volumskem razmerju 8:2.

Hitrost eluiranja - 2,0 cm 3 /min.

Volumen vbrizganega vzorca je 20 µl.

Občutljivost ojačevalnika je izbrana tako, da intenziteta signalov benzo (a) pirena in internega standarda - benzo (b) krizena ne presega 95% lestvice.

Čas analize - 15 min; retencijski čas benzo(a)pirena - 5 min, benzo(b)krizena -13 min.

Analizirane raztopine dvakrat kromatografiramo pod enakimi pogoji. Površine vrhov se merijo z integratorjem ali ročno kot produkt višine vrha in njegove širine na polovici višine.

Določanje vsebnosti benzo(a)pirena se izvaja z metodo internega standarda ali z metodo dodatkov.

5.3.2.2 Določanje vsebnosti benzo(a)pirena v raztopini (ekstraktu), dobljeni po 5.3.1 z metodo internega standarda

Pri uporabi te metode kvantitativnega ocenjevanja se kromatograf predhodno umeri z uporabo umeritvenih raztopin, pripravljenih v skladu s 5.2.5.

Pod pogoji iz 5.3.2.1 posnemite tri kromatograme za vsako od pripravljenih raztopin in izmerite površine vrhov benzo(a)pirena in benzo(b)krizena. Določite aritmetično sredino površine vrhov benzo(a)pirena in benzo(b)krizena, izračunano iz treh kromatogramov.

Kalibracijski koeficient K se izračuna po formuli

kjer sta in in 2 masi benz (a) pirena (/l]) in benzo (b) krizena (t 2), μg, vnesenih v kromatograf; 5) in ^2 - površine vrhov benz(a)pirena (.9]) in benzo(b)krizena (A^), cm 3 .

Za vsako raztopino se izračuna umeritveni koeficient K.

Njegove vrednosti se ne smejo razlikovati od aritmetične sredine kalibracijskega faktorja iz vseh rezultatov za več kot 10%.

Pri valovni dolžini vzbujanja 300 nm in emisijskem filtru 418 nm je vrednost kalibracijskega faktorja 9,5.

Pred začetkom analize v fazi priprave vzorcev za alkalno hidrolizo vzorcu produkta in vzorcu kontrolnega poskusa dodamo 50 μl raztopine benzo(b)krizena z masno koncentracijo 0,5 μg/cm 3 . Oba vzorca se preneseta skozi vse preskusne korake, določene v 5.3.1. Suh ostanek raztopimo v 200 µl acetonitrila.

Pod pogoji iz 5.3.2.1 posnemite kromatograma raztopine benz (a) pirena z masno koncentracijo 100 μg / cm 3 in raztopine benzo (b) krizena z masno koncentracijo 100 μg / cm 3 , upoštevajte čas sproščanja benz (a) pirena in benz (c) hrizena. Nato se posnameta kromatograma kontrolnega vzorca z dodatkom benzo(b)krizena in vzorca produkta z enakim dodatkom benzo(b)krizena. Izmerite površine vrhov benzo(a)pirena in benzo(b)krizena na kromatogramih vzorca produkta in kontrolnega vzorca.

Za vsak vzorec se posnameta dva kromatograma. Iz dveh kromatogramov se izračuna aritmetična sredina površine vrhov benzo(a)pirena in benzo(b)krizena.

Na podlagi dobljenih podatkov določimo maso benzo(a)pirena, mcg, v vzorcu produkta m\ in vzorcu kontrolnega poskusa m 2 .







„72 je masa benzo(a)pirena v vzorcu kontrolnega poskusa, mcg; t st masa benzo(v)krizena, vnesenega v vzorec proizvoda in kontrolni vzorec, mcg;

S"] in S 2 - površine vrhov benzo(a)pirena na kromatogramih vzorca produkta (.S"]) in kontrolnega vzorca (.S/), cm 2;

L/, L/ - površine vrhov benz(b)krizena na kromatogramih vzorca produkta (.SS) in kontrolnega vzorca (L/), cm 2 ;

K je kalibracijski faktor, določen v skladu s 5.3.2.2.

5.3.2.3 Določanje vsebnosti benzo(a)pirena v raztopini (ekstraktu), dobljeni po 5.3.1 z adicijsko metodo

Za kvantifikacijo pri uporabi adicijske metode se vzorec kontrolnega poskusa analizira istočasno z vzorcem produkta. Frakcije, izolirane iz vzorcev produkta in kontrolne serije v skladu s 5.3.1, se raztopijo v 400 µl acetonitrila. Dobljene raztopine razdelimo na dva dela, manjši del (40 µl) damo v epruveto ali hruškasto bučko.

Zabeležite kromatograme vzorcev produkta, kontrolnih vzorcev in kromatogram raztopine benzo(a)pirena z masno koncentracijo 0,25 μg/cm 3 . Upoštevajte čas sproščanja benzo(a)pirena.

V preostale dele vzorca produkta in kontrolne izkušnje (360 μl) dodamo 10 - 20 μl raztopine benzo(a)pirena masne koncentracije 5 μg/cm 3 . Nastale raztopine se ponovno vnesejo v kromatograf.

Vsi kromatogrami se posnamejo v dvojniku. Izmerijo se površine vrhov benzo(a)pirena. Iz dveh kromatogramov se izračuna aritmetična sredina površine vrha benzo(a)pirena.

Na podlagi dobljenih podatkov določimo maso benzo(a)pirena, μg, v vzorcu produkta /77] in vzorcu kontrolnega poskusa t 2:

t op ■ S 1 . _ t do ■ S 3 (9)

S 2 - 0,95) ' 2 5 4 - 0,95 3 '


kjer je /77 op in /77 k masa benzo(a)pirena, dodanega delu ekstrakta iz vzorca proizvoda (t op) in kontrolnega vzorca (/%), μg;

S"] in S 2 - površine vrhov benzo(a)pirena na kromatogramih vzorca produkta (.S"]) in vzorca produkta z dodatkom benzo(a)pirena (L/), cm 2;

L/ in.S) - površine vrhov benzo(a)pirena na kromatogramih vzorca kontrolnega poskusa (L/) in vzorca kontrolnega poskusa z dodatkom benzo(a)pirena (L/), cm 2;

0,9 je delež vzorca, ki mu je dodan benz(a)piren.



5.3.3 Določanje vsebnosti benz(a)pirena s spektrofluorimetrijo pri sobni temperaturi

Pri določanju vsebnosti benzo(a)pirena s spektrofluorimetrijo sočasno z vzorcem produkta analiziramo vzorec kontrolnega poskusa, ki mu dodamo 50 μl raztopine benzo(a)pirena z masno koncentracijo 1 μg. /cm 3 se doda.

Frakcije, ki vsebujejo benzo(a)piren, dobljene po 5.3.1 iz vzorca produkta in kontrolnega vzorca z dodatkom, raztopimo v 0,5 cm 3 benzena in nato dodatno prečistimo v tankem sloju acetilirane celuloze.

Da bi to naredili, ploščo 20 x 20 cm, pripravljeno, kot je navedeno v 5.2.2, razdelimo na dve polji: stransko polje širine 1,5–2 cm in glavno polje, pri čemer s skalpelom oz. tanko lopatico. Raztopino frakcije, izolirane v skladu s 5.3.1, nanesemo na glavno polje z neprekinjenim trakom, ki odstopa 2 cm od spodnjega roba plošče in 1 cm od stranskih robov. Raztopino nanašamo s tanko vlečeno kapilaro ali mikrobrizgalko, velikost madežev ne sme presegati 5 mm. Za kvantitativni prenos snovi jo dvakrat speremo s sten bučke z majhno količino benzena (0,4 - 0,6 cm 3). Na startno črto stranskega polja na točko nanesemo 5 μl raztopine benzo(a)pirena z masno koncentracijo 1 μg/cm 3. Po popolnem izhlapevanju topila se plošča postavi v predhodno nasičeno kromatografsko komoro pod kotom 70° - 85° in eluira se z mešanico etilnega alkohola, acetona in vode, vzetih v razmerju 60: 25:15. Ko fronta topila doseže 2 cm od zgornjega roba plošče, jo odstranimo iz komore, posušimo na zraku in pod ultravijolično žarnico razvijemo kromatografsko cono benzo(a)pirena. Sorbent iz cone benz(a)pirena iz glavnega polja postrgamo s plošče s skalpelom ali tanko spatulo in prenesemo v stekleni filter, iz katerega snov v več korakih eluiramo s 50 cm 3 benzena v bučke. s prostornino 100 cm 3, nato topilo uparimo na majhno prostornino, preostanek topila odstranimo s tokom zraka in v bučko dodamo 1 cm 3 benzena.

Na spektrofluorimetru pri valovni dolžini vzbujajoče svetlobe 386 nm v območju 400 - 440 nm pri hitrosti skeniranja 60 nm/min fluorescenčni spekter vzorca produkta in kontrolnega vzorca z dodatkom benzo(a)pirena. so zabeleženi.

Spektri raztopin se posnamejo v enem načinu ojačanja, pri čemer prilagodimo vrzel in faktor ojačanja glede na raztopino kontrolnega vzorca, tako da je signal benzo(a)pirena pri 406 nm 0,4 - 0,6 skale instrumenta. Za vsako raztopino se spekter posname dvakrat, s čimer se doseže dobra ponovljivost. Na dobljenih spektrogramih pri maksimumu pri 406 nm izmerimo v milimetrih višino spektralne črte benzo(a)pirena za vzorec produkta in kontrolni vzorec. Izračunajte povprečno vrednost višin benzo(a)pirena po dveh spektrogramih. Pri visokih vsebnostih benzo(a)pirena v izdelku se vzorci razredčijo z benzenom in spekter se ponovno posname v enakem načinu ojačanja kot za kontrolni vzorec.

Izvedite dve vzporedni določitvi.

5.4 Rezultati obdelave

5.4.1 Masni delež benz (a) pirena v produktu X \,%, ali X 2, mg / kg, pri uporabi metode tekočinske kromatografije visoke ločljivosti, se izračuna po formulah:


(t 1 - t 2) ■ 100 (t g - t 2) t ■ 1000 1000 “t 10






kjer je mi masa benzo(a)pirena v vzorcu proizvoda, μg;

m2 masa benzo(a)pirena v kontrolnem vzorcu, μg; t je masa izdelka, vzetega za analizo, g.

5.4.2 Masni delež benz(a)pirena v produktu A), % ali X 2 , mg/kg, pri uporabi spektrofluorimetrične metode se izračuna po formulah:



S st NU- 100 s ST // V t ■ 1000 ■ 1000 ■






kjer je cst masna koncentracija benzo(a)pirena v delovni raztopini, pripravljeni v skladu s 5.2.4 in dodani kontrolnemu vzorcu, μg/cm 3 ;

višina spektralne črte benzo(a)pirena na spektrogramu vzorca produkta, mm; višina spektralne črte benzo(a)pirena na spektrogramu vzorca kontrolnega poskusa, mm;

V je prostornina delovne raztopine benz (a) pirena, dodanega vzorcu kontrolnega poskusa, cm 3; t je teža vzorca izdelka, vzetega za testiranje, g.

Končni rezultat preskusa se vzame kot aritmetična sredina dveh vzporednih določitev z enakim številom pomembnih števk.

Če razlika med rezultati vzporednih določitev ne presega \X-y - YY 2 |<

< 0,01 dX, где, Х 2 и X- результаты параллельных определений и их среднее арифметическое, а d - норматив контроля сходимости, то среднее арифметическое X принимают за результат анализа. В противном случае анализ повторяют. Значение норматива d приведено в таблице 3.

Glede na rezultat analize X in vrednost relativne napake d iz tabele 3 izračunajte absolutno napako A = 0, (SH

Rezultat analize je predstavljen kot (X ± A), mg/kg ali % pri P = 0,95.

5.5 Kontrola točnosti rezultatov analize

5.5.1 Ponovljivost ponavljajočih se določitev preveri za vsak vzorec, analiziran v skladu s 5.3.

5.5.2 Delovni vzorci se uporabljajo za kontrolo ponovljivosti. Vzorec razdelimo na dva enaka dela in analiziramo v skladu z metodologijo v različnih laboratorijih ali v istem laboratoriju, pri čemer čim bolj variiramo pogoje analize, tj. različni analitiki.

Ponovljivost kontrolnih analiz se šteje za zadovoljivo, če \ X-y - X 2 \<

< 0,01 DX, где Л), Х 2 и X- результаты анализа одной и той же пробы, полученные в разных лабораториях или при варьирующих условиях в одной лаборатории и их среднее арифметическое значение, D - значение норматива внутреннего оперативного контроля воспроизводимости. Значение норматива D приведено в таблице 3.

Pogostost kontrole obnovljivosti - vsaj enkrat na dva tedna

Tabela 3 - Merilno območje, vrednost karakteristike relativne napake in standardi za obratovalno kontrolo naključne komponente relativne napake (konvergenca in ponovljivost) s stopnjo zaupanja P = 0,95

5.5.3 Za kontrolo točnosti uporabite delovne vzorce z znanim dodatkom benzo(a)pirena. Vzorec razdelimo na dva enaka dela, od katerih prvega analiziramo po postopku, v drugega pa dodamo znani dodatek benzo(a)pirena in ga nato tudi analiziramo po postopku. Vrednost dodatka naj bo 50 - 150 % vsebnosti benzapirena v analiziranem vzorcu.

Natančnost kontrolnih analiz se šteje za zadovoljivo, če |L) - X- s \< К, где Л), X и с - результаты контрольных анализов пробы с добавкой бенз(а)пирена, реальной пробы и величина добавки бенз(а)пирена соответственно; К - норматив оперативного контроля точности.

Vneseno v FSUE "STANDARTINFORM" na osebnem računalniku.

Natisnjeno v podružnici FSUE "STANDARTINFORM" - vrsta. "Moskovski tiskar", 105062 Moskva, Lyalin per., 6

GOST R 51650-2000

1 področje uporabe ............................................ ... ......... 1

3 Vzorčenje ................................................. ............... ................ 2

4 Metoda nizkotemperaturne spektrofluorimetrije .............................. 2

4.1 Aparature, materiali in reagenti ............................................ ... 2

4.2 Priprava na test ............................................. .................. ... 3

4.3 Izvajanje testa ............................................. ............. .... 3

4.4 Obdelava rezultatov.................................................. ................. .... 6

4.5 Preverjanje točnosti rezultatov analize.................................................. ..... 6

5 Metode tekočinske kromatografije visoke ločljivosti in spektrofluorimetrije za

sobna temperatura ................................................ ................ ...... 7

5.1 Aparature, materiali in reagenti ............................................ ... 8

5.2 Priprava na test ............................................. .................. ... 9

5.3 Izvajanje testa ............................................. ............. ....10

5.4 Obdelava rezultatov..................................................... ................ ....13

5.5 Preverjanje točnosti rezultatov analize.................................................. ..................14

6 Varnostne zahteve ............................................. ................ 15

7 Zahteve za usposobljenost operaterja.................................. .15

Dodatek A Bibliografija

DRŽAVNI STANDARD RUSKE FEDERACIJE

ŽIVILSKI IZDELKI Metode za določanje masnega deleža benzo(a)pirena

Metode za določanje deleža benz(a)pirena v skupni masi

Datum uvedbe 2001-07-01

1 področje uporabe

Ta mednarodni standard se uporablja za živilske surovine, živila, aditive za živila in aditive za okus ter določa metode za določanje masnega deleža benzo(a)pirena z uporabo spektrofluorimetrije pri nizki in sobni temperaturi ter tekočinske kromatografije visoke ločljivosti.

Laboratorijske tehtnice za splošno uporabo 2. razreda točnosti z najvišjo mejo tehtanja 500 g po GOST 24104.

Rotacijski uparjalnik IR-1M.

Kopalna voda.

Gospodinjski električni štedilnik z zaprto spiralo in regulatorjem ogrevanja po GOST 14919.

Dewarjeva posoda za tekoči dušik poljubne prostornine

Kopeli za kromatografijo (emajlirane fotokivete).

Stekleni krožniki dimenzij 15 x 30 in 20 x 40 cm.

Bučke K-1-250-29/32 THS, K-1-100-29/32 THS, K-1-500-29/32 THS ali P-1-500-29/32 THS po GOST 25336.

Hladilniki KHIT-1-300-14/23 XC ali KHIT-1-400-14/23 XC po GOST 25336.

Hladilniki KhPT-2-400-29/32 KhS in KhPT-1-300-29/32 ali KhPT-400-29/32 KhS po GOST 25336.

Deflegmator 250-19/26-29/32 TS ali deflegmator 300-19/26-29/32 TS po GOST 25336.

Steklene epruvete P2-10-180 XC po GOST 25336.

Šoba P-1-19 / 26-14 / 23 TC ali H2-19 / 23 po GOST 25336.

Laboratorijska črpalka z vodnim curkom po GOST 25336.

Pipete s prostornino 1, 2, 5, 10 cm 3 po GOST 29228 in GOST 29229.

Lijak VFO-32-POR 100-14/23 XC ali VFO-32-POR 160-14/23 XC po GOST 25336.

Merjene epruvete P-2-15-14/23 XC po GOST 1770.

Lij ločnik VD-1-500 ali VD-3-500 po GOST 25336.

Dimenzionalni cilindri 1-100, 1-250 ali 3-100, 3-250 po GOST 25336.

Skodelice za tehtanje (vrečke za steklenice) SV-14/8 ali SV-19/9 ali SV-24/10 ali SV-34/12 po GOST 25336.

Termometer z mejami merjenja temperature 0-250 ° C z vrednostjo delitve 1 ° C po GOST 29224.

Steklene kapilare, steklene palice.

n.oktan, h., v skladu z normativnim dokumentom.

n.heksan, h., v skladu z normativnim dokumentom.

Rektificirani tehnični etilni alkohol po GOST 18300 ali rektificirani etilni alkohol po GOST R 51652.

Frakcija petrol etra 40 - 70 ° C v skladu z normativnim dokumentom.

Aluminijev oksid za kromatografijo 2. stopnje aktivnosti v skladu z normativnim dokumentom.

Benz (a) piren, vsebnost glavne snovi ni manjša od 98%.

1,12-benzperilen, vsebnost glavne snovi ni manjša od 98%.

Dovoljeno je uporabljati druge merilne instrumente z meroslovnimi značilnostmi in opremo s tehničnimi lastnostmi, pa tudi reagente in materiale kakovosti, ki ni nižja od navedene.

4.2 Priprava na test

4.2.1 Čiščenje topil

Topila (n. oktan, etilni alkohol, petroleter, kloroform in n. heksan) destiliramo na običajen način s povratnim kondenzatorjem.

4.2.2 Priprava aluminijevega oksida

Aluminijev oksid sušimo v sušilniku pri temperaturi (250 + 4) ° C 4 ure in shranimo v posodo z brušenim zamaškom.

4.2.3 Priprava raztopine benz(a)pirena za tankoplastno kromatografijo (pričevalna raztopina).

V tehtič odtehtamo približno 10 mg benzo(a)pirena, dodajamo nekaj mililitrov petroletra, dokler se vzorec popolnoma ne raztopi.

Nastalo raztopino kvantitativno prenesemo v merilno bučko s prostornino 100 cm 3 in raztopino naravnamo na oznako s petroletrom. Rok uporabnosti raztopine v hladilniku ni več kot tri mesece.

4.2.4 Priprava standardne raztopine benz(a)pirena

V tehtič odtehtajte (10,0 ± 0,2) mg benzo(a)pirena, dodajte nekaj mililitrov n.oktana, dokler se vzorec popolnoma ne raztopi. Nastalo raztopino kvantitativno prenesemo v merilno bučko z brušenim zamaškom prostornine 100 cm 3 in dovedemo do oznake z n.oktanom. Masna koncentracija benzo(a)pirena v nastali raztopini je 100 µg/cm 3 . Raztopino hranimo v hladilniku. Rok uporabnosti raztopine ni daljši od treh mesecev.

4.2.5 Priprava delovnih raztopin benzo(a)pirena

Delovne raztopine benzo(a)pirena masne koncentracije 0,1; 0,04 in 0,02 µg/cm 3 v n.oktanu pripravimo s sekvenčnim redčenjem začetne standardne raztopine benzo(a)pirena, pripravljene po 4.2.4, v merilnih bučkah z brušenim zamaškom prostornine 100 cm 3 . Raztopine shranjujemo v hladilniku. Rok uporabnosti raztopine ni daljši od enega meseca.

4.2.6 Priprava standardne raztopine 1,12-benzperilena (interni standard)

Za pripravo začetne raztopine v stekleničko odtehtamo (10,0 + 0,2) mg 1,12-benzperilena, dodamo nekaj mililitrov n.oktana, dokler se vzorec popolnoma ne raztopi. Nastalo raztopino kvantitativno prenesemo v merilno bučko z brušenim zamaškom prostornine 100 cm 3 in dovedemo do oznake z n.oktanom. Masna koncentracija 1,12-benzperilena v nastali raztopini je 100 µg/cm 3 . Raztopino hranimo v hladilniku. Rok uporabnosti raztopine ni daljši od treh mesecev.

4.2.7 Priprava delovnih raztopin 1,12-benzperilena (interne standardne raztopine)

Delovne raztopine 1,12-benzperilena masne koncentracije 0,01; 0,005; 0,002 in 0,001 μg / cm3

pripravljeno v n.oktanu z zaporednimi razredčitvami začetne standardne raztopine, pripravljene v skladu s 4.2.6, v merilnih bučkah z brušenim zamaškom s prostornino 100 cm3. Raztopine shranjujemo v hladilniku. Rok uporabnosti raztopine ni daljši od enega meseca.

4.3 Izvedba testa

4.3.1 Ločevanje benzo(a)pirena iz produkta

V bučko z okroglim dnom s prostornino 500 cm 3 damo vzorec produkta, ki tehta 25 g, v bučko dodamo 20 cm 3 destilirane vode, 200 cm 3 etilnega alkohola in 20 g kalijevega hidroksida.

Vsebino bučke premešamo s stresanjem. Bučko priključimo na povratni kondenzator in segrevamo na vodni kopeli z reakcijsko mešanico, ki vre 3 ure.Nato v bučko skozi kondenzator dodamo 150 cm 3 vode; bučko odstranimo iz kopeli in ohladimo na sobno temperaturo.

Po ohlajanju se tekoča faza reakcijske zmesi z dekantacijo prenese v lij ločnik, ostanek produkta pa ostane v bučki. V bučko z ostankom dodamo 150 cm3 n-heksana, vsebino bučke močno premešamo in n-heksan oddekantiramo v lij ločnik.

Lij se zamaši in močno pretrese, nato pa se pritrdi v rešetko in pusti, da se tekočine ločijo. Za ločevanje nastale emulzije dodamo mešanici v liju ločniku 20 cm 3 etilnega alkohola. Po ločitvi spodnjo vodno-alkoholno fazo prelijemo nazaj v bučko z oborino, heksanski ekstrakt pa vlijemo v 500 cm 3 bučko.

To obdelavo reakcijske zmesi izvedemo še dvakrat, pri čemer uporabimo 100 cm3 n-heksana za ekstrakcijo in etilnega alkohola za ločevanje emulzije, v obrokih po 20 cm3.

Po koncu ekstrakcije ostanek v bučki in hidrolizat zavržemo, ekstrakt pa speremo v liju ločniku z destilirano vodo trikrat po 50 cm 3 in po delih uparimo v bučki z okroglim dnom s prostornino 250 cm 3 predhodno stehtanega na drugo decimalno mesto na rotacijskem uparjalniku pri temperaturi vodne kopeli, ki ni višja od 60 °С. Bučko z ekstraktom pustimo v dimni komori, da odstranimo sledi topila, nato jo ponovno stehtamo. Teža ekstrahiranega ekstrakta se določi z razliko med tehtanji.

Iz ekstrakta v bučki odvzamemo 1/5 del v steklenico brez tehtanja. Bučka s preostankom ekstrakta se stehta. V stekleničko z delom ekstrakta dodamo 0,1-0,2 cm 3 raztopine "witness" benz(a)pirena, pripravljene po 4.2.3. Vsebino steklenice in ostanek v bučki raztopimo v majhnem volumnu petroletra.

Za kromatografsko ločitev ekstrakta aluminijev oksid enakomerno vlijemo na stekleno ploščo velikosti 20x40 cm. Nato s stekleno palico, razdeljeno na tri dele (14, 1 in 3 cm) z gumijastimi obroči debeline 1 mm in širine 3 mm, previdno poravnamo aluminijev oksid.

Dobljene raztopine kvantitativno nanesemo na pripravljeno ploščo s steklenimi kapilarami: na ozkem delu - raztopino iz steklenice ("priča"), na širokem delu - ekstrakt produkta iz bučke. Raztopine enakomerno nanesemo v neprekinjenem traku, pri čemer odstopimo od spodnjega roba plošče 7-8 cm.

Ploščo postavimo v kromatografsko kopel pod rahlim kotom 20° - 25°, vlijemo petroleter, tako da ne doseže črte za nanašanje vzorca. Kopel pokrijemo s steklom in izvedemo kromatografijo, pri čemer topilo pripeljemo do zgornjega roba plošče.

Brez sušenja ploščo obsevamo z ultravijolično svetlobo in lokacijo benzo(a)pirena v preskusnem vzorcu določimo s svetlobnim pasom "priče". Na kromatogramu preskusnega vzorca označite meje pasu benzo(a)pirena. Plošča se suši na zraku v dimni komori.

Trak aluminijevega oksida, označen na kromatogramu preskusnega vzorca, odstranimo s plošče s pomočjo predmetnega stekla in ga kvantitativno prenesemo na porozno ploščo lijaka filtra. Lij povežemo z bučko z okroglim dnom s prostornino 100 cm 3 in benzo(a)piren eluiramo iz aluminijevega oksida s 50 cm 3 benzena, dodajamo benzen v majhnih porcijah in mešamo aluminijev oksid na lijaku s palico. Benzen uparimo do suhega na rotacijskem uparjalniku pri temperaturi vodne kopeli, ki ne presega 60 °C. Ostanek v bučki smo z oktanom kvantitativno prenesli v epruveto. Prostornina raztopine v epruveti ne sme presegati 5 cm 3 .

Pri analizi nekaterih produktov med primarno kromatografijo ekstrakta, izoliranega iz produkta, ni popolne in jasne ločitve fluorescenčnih komponent vzorca. V tem primeru je na plošči na ravni "priče" izoliran širši trak aluminijevega oksida; benz(a)piren eluiramo iz aluminijevega oksida z benzenom, kot je opisano zgoraj, in ostanek po izhlapevanju raztopimo v etanolu in nastali alkoholni ekstrakt ponovno kromatografiramo.

Za kromatografsko ločevanje alkoholnega ekstrakta uporabimo ploščo 15 x 30 cm s plastjo aluminijevega oksida debeline 0,3 mm. Na ploščo ločimo trakove širine 10 in 3 cm, na široki del plošče s stekleno kapilaro nanesemo alkoholni izvleček analiziranega produkta in raztopino benzo (a) pirena v petrol etru (»priča«). raztopino) nanesemo na ozek del plošče Ploščo postavimo v kopel pod kotom 20 - 25 ° in izvedemo kromatografijo v kloroformu, pri čemer topilo pripeljemo do zgornjega roba plošče. V ultravijolični svetlobi "priča" opazi pas aluminijevega oksida z benzo (a) pirenom proučevanega izdelka. Nato se benzo(a)piren eluira iz aluminijevega oksida z benzenom in vsi nadaljnji postopki se izvedejo, kot je opisano zgoraj.

GOST R 51650-2000

Raztopino benzo(a)pirena v n.oktanu prenesemo v epruveto. Prostornina raztopine ne sme presegati 5 cm 3 z začetnim vzorcem produkta 25 g.

V dobljeni raztopini (ekstraktu) določimo vsebnost benz(a)pirena z metodo nizkotemperaturne spektrofluorometrije z uporabo adicijske metode ali metode internega standarda za kvantitativno oceno.

4.3.2 Določanje vsebnosti benzo(a)pirena v raztopini (ekstraktu), dobljeni po 4.3.1 z adicijsko metodo.

V tri epruvete s pipeto vlijemo 1 cm 3 nastale raztopine benzo(a)pirena v n.oktanu. Nato v prvo epruveto vlijemo 2 cm 3 n.oktana. V drugo epruveto vlijemo 1,5 cm 3 n.oktana in 0,5 cm 3 delovne raztopine benz(a)pirena, masne koncentracije 0,1 µg/cm 3, pripravljene po 4.2.5. V tretjo epruveto dodamo 1 cm 3 n.oktana in 1 cm 3 enake delovne raztopine benzo(a)pirena kot v drugi epruveti.

Spektrofluorimetrična analiza se začne s tretjo epruveto. Da bi to naredili, tretjo epruveto postavimo v Dewarjevo posodo s tekočim dušikom pred vhodno režo spektrofotometra; nastavite analitično fluorescenčno linijo benzo(a)pirena 403 nm pri valovni dolžini vznemirljive svetlobe 367 nm. S prilagajanjem ojačanja in odpiranjem reže ter hkratnim prilagajanjem epruvete v Dewarjevi posodi dosežemo maksimalni signal s snemalno napravo spektrofotometra (do 50 - 80%), po katerem se spektrogram benzo ( a) piren se zabeleži v območju 401 - 404 nm, pri čemer se določi vrednost spektrofotometra snemalne naprave pri valovni dolžini 401 nm. Posnetek spektra se ponovi dvakrat.

Nato drugo in prvo epruveto zaporedno zamrznemo v tekočem dušiku in posnamemo spektre fluorescence v območju valovnih dolžin 401 - 404 nm, ne pozabite nastaviti snemalnega peresa pri valovni dolžini 401 nm v isti položaj kot pri skeniranju vzorca v tretja cev.

Masno koncentracijo benzo(a)pirena v analiziranem ekstraktu določimo po grafu, na katerem je vrednost dodatka benzo(a)pirena (µg) na abscisni osi, višina vrha maksimuma Vzdolž ordinatne osi je narisana karakteristična črta benzo(a)pirena pri 403 nm, merjeno iz dobljenih spektrogramov v milimetrih.

Če masna koncentracija benzo(a)pirena v preskusni raztopini sodi v območje, primerno za meritve, potem dobljene eksperimentalne točke ležijo na isti premici. Ekstrapolacija te premice do presečišča z abscisno osjo da segment na njej, ki ustreza vsebnosti benzo (a) pirena v raztopini brez dodatka, to je v 1 cm 3 preskusne raztopine. Če je masna koncentracija benzo(a)pirena v analizirani raztopini višja od zgornje meje območja koncentracij, ki jih meri naprava, se analizirana raztopina razredči z n.oktanom.

4.3.3 Določanje vsebnosti benzo(a)pirena v raztopini (ekstraktu), dobljeni po 4.3.1 z metodo internega standarda

Kot interni standard se uporablja 1,12-benzperilen. V epruveto vlijemo 3 cm 3 raztopine benz(a)pirena v n.oktanu, dobljene po 4.3.1, in jo postavimo v Dewarjevo posodo s tekočim dušikom pred vhodno režo spektrofotometra, nastavite analitično črto na 403 nm pri valovni dolžini vzbujajoče svetlobe 367 nm in izvedite snemanje spektra raztopine v območju valovnih dolžin 401 - 409 nm. Iz intenzitete črte (glede na višino vrha maksimuma karakteristične črte benzo(a)pirena pri 403 nm) ocenimo približno vsebnost benzo(a)pirena v vzorcu. V skladu s to oceno nato v epruveto s 3 cm 3 raztopine benz(a)pirena v n.oktanu dodamo raztopino 1,12-benzperilena v takšni količini, da je intenzivnost 1,12- benzperilena v spektru vzorca pri

406,3 nm je bila 3–5-krat večja od intenzitete linije benz(a)pirena pri valovni dolžini 403 nm.

Spekter se posname v območju valovnih dolžin 401 - 409 nm dvakrat.

Intenziteta značilnih linij benz(a)pirena pri 403 nm in 1,12-benzperilena pri

406,3 nm (H| oziroma H 2) se določi iz spektrogramov z merjenjem višin vrhov na maksimumu značilnih linij teh spojin v milimetrih. Pri izračunih vzemite povprečno vrednost. Izračuna se koeficient razmerja (K) med intenzivnostjo linije benz (a) pirena (EGD) in intenzivnostjo linije 1,12-benzperilena (EG 2), K = //]/// 2.

Nato se ta koeficient določi za standardne raztopine benzo(a)pirena (X st). Da bi to naredili, v dve epruveti vlijemo 3 cm 3 standardne raztopine benz (a) pirena z masno koncentracijo 0,02 in 0,04 μg / cm 3. V vsako od epruvet vlijemo enako količino 1,12-benzperilena kot v epruveto z vzorcem. Spektri vsake raztopine so posneti dvakrat v območju valovnih dolžin 401 - 409 nm.

Hkrati je treba zagotoviti, da je položaj snemalnega peresa pri valovni dolžini 401 nm v vseh primerih fiksiran na isti ravni.

Nato se iz spektrogramov določi intenziteta značilnih linij benz(a)pirena pri 403 nm in 1,12-benzperilena pri 406,3 nm (W oziroma H 2 ). Pri izračunih vzemite povprečno vrednost. Izračunajte K st \u003d H ^ H 2 za vsako koncentracijo benzo (a) pirena.

Masno koncentracijo benzo(a)pirena v analizirani raztopini c, µg/cm 3, izračunamo po formuli:

s st *K/K st, (1)

kjer je c st koncentracija benzo(a)pirena v standardni raztopini, µg/cm 3 ;

K je koeficient, ugotovljen iz spektrograma analizirane raztopine z dodatkom 1,12-benzperilena;

K C1 - koeficient, ugotovljen iz spektrogramov standardne raztopine benz (a) pirena z dodatkom 1,12-benzperilena, katerega vrednost je bližja vrednosti koeficienta analizirane raztopine z ustreznim dodatkom 1, 12-benzperilen.

Izvajata se dve vzporedni določitvi in ​​hkrati kontrolni poskus, ki poteka skozi vse faze analize z uporabo vseh reagentov po postopku, vendar brez vzorca produkta.

4.4 Rezultati obdelave

Masni delež benz (a) pirena L),%, X in X 2, mg / kg, se izračuna po formulah:

= (s - er) ■m l V ■ 100 = (s - er) ■ t 1 ■ V (2)

3 t 2 ■ t ■ 1000 ■ 1000 t 2 ■ t ’

_ (s - s 0) ■ V ■ t 1 (3)

kjer je c koncentracija benzo(a)pirena, ugotovljena v skladu s 4.3.2 ali 4.3.3 v raztopini (ekstraktu) analiziranega produkta, dobljenega v skladu s 4.3.1, µg/cm 3 ; c 0 koncentracija benzo(a)pirena v raztopini kontrolnega poskusa, dobljena v skladu s 4.3.1, µg/cm 3 ; V je prostornina raztopine benzo(a)pirena, izolirane iz analiziranega vzorca proizvoda, cm3;

/«I - masa ekstrakta, izoliranega iz analiziranega proizvoda, g; m 2 - masa ekstrakta, nanesenega na širok trak plošče, g; t je masa vzorca proizvoda, g.

Rezultat je zaokrožen na drugo pomembno številko.

Za končni rezultat določanja se vzame aritmetična sredina dveh vzporednih določanj z enakim številom pomembnih števk.

Če razlika med rezultati vzporednih določanj ne presega |A) - X 2 \<

< 0,01яЖ, где Xi, Х 2 и X- результаты первого и второго параллельных определений и их среднеарифметическое, a d- норматив контроля сходимости, то среднеарифметическое X принимают за результат анализа. В противном случае анализ повторяют. Значение норматива контроля сходимости d приведено в таблице 1.

Na podlagi rezultata analize X in vrednosti relativne napake d, podane v tabeli 1, se izračuna absolutna napaka A = 0, (SD mg/kg ali %).

Rezultat analize je predstavljen kot (X ± A), mg/kg ali % pri P = 0,95.

4.5 Kontrola točnosti rezultatov analize

Notranja operativna kontrola (IQA) kakovosti rezultatov analize vključuje kontrolo konvergence, ponovljivosti in točnosti rezultatov analize.

4.5.1 Ponovljivost ponavljajočih se določitev preveri za vsak vzorec, analiziran v skladu s 4.4.

4.5.2 Za notranji nadzor obnovljivosti se uporabljajo delovni vzorci. Vzorec razdelimo na dva enaka dela in analiziramo v skladu z metodologijo v različnih laboratorijih ali v istem laboratoriju, pri čemer čim bolj variiramo pogoje analize, tj. različni analitiki.

Ponovljivost kontrolnih analiz velja za zadovoljivo, če \X^ - X 2 \<

< 0,01 DX, где X/, Х 2 и X- результаты анализа одной и той же пробы, полученные в разных лабораториях или при варьирующих условиях в одной лаборатории и их среднеарифметическое значение, D - значение норматива внутреннего оперативного контроля воспроизводимости. Значение норматива D приведено в таблице 1.

GOST R 51650-2000

Pogostnost kontrole obnovljivosti je vsaj enkrat na dva tedna.

Tabela 1 - Merilno območje, vrednost karakteristike relativne napake in standardi za obratovalno kontrolo naključne komponente relativne napake (konvergence in ponovljivosti) pri stopnji zaupanja Р = 0,95

4.5.3 Za kontrolo točnosti uporabite delovne vzorce z znanim dodatkom benzo(a)pirena. Vzorec se razdeli na dva enaka dela, od katerih enega analiziramo po postopku; v drugem pa uvedemo znan dodatek benzo(a)pirena in ga nato tudi analiziramo po postopku. Vrednost dodatka naj bo 50 - 150 % vsebnosti benzapirena v analiziranem vzorcu.

Natančnost kontrolnih analiz velja za zadovoljivo, če \Xy-X-c\< 0,01 К, где Ху, Xи с - результаты контрольных анализов пробы с добавкой бенз(а)пирена, реальной пробы и величина добавки бенз(а)пирена, соответственно; К- норматив оперативного контроля точности. Норматив оперативного контроля точности рассчитывают по формулам: при проведении внутрилабораторного контроля (Р = 0,90)

K \u003d 0,84 V (A X]) 2 + (A x) 2; (4)

med zunanjim nadzorom (P = 0,95)

K \u003d V (A ^) 2 + (A z) 2, (5)

kjer so A ^ + A x vrednosti značilnosti napake, ki ustrezajo masni koncentraciji

benzo(a)piren v vzorcu z dodatkom in v pravem vzorcu;

Ay, \u003d 0,01 Xy in A x \u003d 0,01d x X, kjer sta Xy in X masni delež benzo (a) pirena v vzorcu z dodatkom

in v realnem vzorcu % ali mg/kg.

Vrednost relativne napake d x (8y) je podana v tabeli 1.

Kontrola točnosti analize se izvaja vsaj enkrat na mesec, pa tudi pri menjavi reagentov ali po daljši prekinitvi dela.

Če so standardi obratovalnega nadzora točnosti preseženi, se izvedejo ponovne analize. Če so predpisani standardi večkrat preseženi, se analize prekinejo, razlogi za nezadovoljive rezultate se razjasnijo in odpravijo.

Rezultati WQA se beležijo v posebnem dnevniku.

5 Tehnike tekočinske kromatografije visoke ločljivosti in spektrofluorimetrije pri sobni temperaturi

Bistvo metode je ekstrakcija ogljikovodikov, vključno z benzo(a)pirenom, s heksanom iz produkta, predhodno obdelanega z alkoholno raztopino jedke pepelike, izolacija frakcije policikličnih aromatskih ogljikovodikov, ki vsebuje benzo(a)piren, in čiščenje dobljene frakcije pred motečimi nečistočami na koloni s Sephadexom in v tankem sloju acetilirane celuloze, čemur sledi kvantitativno določanje izoliranega benzo(a)pirena s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti ali spektrofluorimetrijo pri sobni temperaturi.

Razpon določenih vrednosti masnega deleža benz (a) pirena v analiziranih produktih z uporabo metode tekočinske kromatografije visoke ločljivosti in metode spektrofluorimetrije pri sobni temperaturi je 0,0001-0,002 mg / kg ali 0,1 x 10 -7 - 2,0 x 10 -7 %. Optimalno območje določenih masnih koncentracij benzo(a)pirena v raztopini pri uporabi metode tekočinske kromatografije visoke ločljivosti je 0,01-0,02 μg/cm 3 , pri uporabi metode spektrofluorimetrije - 0,02-0,2 μg/cm 3 .

Policiklični aromatski ogljikovodiki: fizikalno-kemijske lastnosti in biološki učinki. Pregled metod za določanje benzapirena. Določanje benzapirena v vodi s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti s fluorescentno detekcijo.

Pošljite svoje dobro delo v bazo znanja je preprosto. Uporabite spodnji obrazec

Študenti, podiplomski študenti, mladi znanstveniki, ki bazo znanja uporabljajo pri študiju in delu, vam bodo zelo hvaležni.

Objavljeno na http://www.allbest.ru/

To delo obsega 30 strani, 1 razdelek, 4 pododdelke, 14 odstavkov, 6 tabel in 9 slik. Na koncu tečaja je seznam referenc, sestavljen iz 14 točk.

Predmet moje raziskave je benzo(a)piren, njegove lastnosti, kancerogeni učinek ter metode za njegovo določanje. V nalogi so predstavljene metode, kot sta plinska kromatografija z masno spektroskopsko detekcijo in tekočinska kromatografija visoke ločljivosti s fluorescenčno detekcijo. Poleg tega so bili obravnavani detektorji, ki so primerni za snemanje analiznega signala benzo(a)pirena, in utemeljena je bila smiselnost uporabe enega ali drugega detektorja.

V okviru tečaja so predstavljene tudi metode določanja benzo(a)pirena v vodi, ki obsegajo pripravo vzorca, kalibracijo kromatografa, analizo in zapisovanje podatkov. V članku so predstavljeni kromatogrami, dobljeni s temi metodami.

Ključne besede: POLICIKLIČNI AROMATIČNI OGLJIKOVODIKI, BENZO(A)PIREN, TEKOČINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE ZMOGLJIVOSTI, PLINSKA KROMATOGRAFIJA, FLUORESCENTNA DETEKCIJA.

Tečajna naloga Tazi vključuje 30 strani, 1 razdelek, 4 pododdelke, 14 točk, 6 masi in 9 številk. Ob robu kurzivnega dela je naveden seznam literature, začenši s 14. točko.

Celta o moji študiji benzo (a) pirena, zanika lastnosti, rakotvorne učinke in nekako metoda za to ni določena. Tečajno delo vključuje metode, kot sta plinska kromatografija z masno spektralno krivuljo in visokoučinkovita kromatografija s fluorescenčno krivuljo. To so detektorji, ki so primerni za analitični sprejem signala iz benzo(a)pirena in upravičeno uporabo na detektorju.

Torej, med delom na bazenu predstavljamo metode za določanje benzo (a) pirena v vodi, ki so sestavljene iz priprave na vzorcu, kalibracije na kromatografu, analize in registracije podatkov. Listina predstavlja podatke, pridobljene po metodologiji.

Ključne misli: POLICIKLIČNA AROMATSKA VODA, Benz(A)PIREN, VISOKO UČINKOVITA TECHNA KROMATOGRAFIJA, PLINSKA KROMATOGRAFIJA, FLUORISCENTNA ODPRTINA.

Tečajna naloga je zajemala 30 strani, 1 razcep, 4 podmape, 14 točk, 6 tabel in 9 risb. Na koncu tečaja je seznam literature, ki obsega 14 točk.

O dejstvu mojega raziskovanja benzo (a) pirena, njegovi moči, rakotvornosti ter metodah njegove identifikacije, fluorescenčne detekcije, detektorjev, ki so primerni za registracijo analitičnega signala na benzo (a) piren, in racionalnosti drugih detektor je utemeljen.

Prav tako je v predmetni nalogi predstavljena metodologija označevanja benzo(a)pirena v vodi, ki je sestavljena iz priprave vzorca, kalibracije kromatografa, analize in registracije podatkov. Roboti so predstavljeni s kromatogrami, vzetimi iz teh metod.

Ključne besede: POLICIKLIČNI AROMATIČNI OGLJIKOVI HIDRATI, Benz(A)PIREN, VISOKO UČINKOVITA RIDINNA KROMATOGRAFIJA, PLINSKA KROMATOGRAFIJA, FLUORESCENTNA DETEKCIJA.

SIMBOLI

UVOD

1. PREGLED LITERATURE

1.1.1 Splošne informacije

1.1.2 Izvor PAH

1.1.4 Biološko delovanje

1.1.5 Benz(a)piren. Splošne informacije

1.2 Metode za določanje benzapirena

1.2.1 Plinska kromatografija

1.3 Določanje benzapirena v vodi s HPLC

1.3.2 Priprava vzorca

1.3.3 Diplomiranje

1.3.4 Izvajanje analize HPLC

1.3.5 Zapisovanje in obdelava podatkov

1.4.2 Kvantifikacija krvnega tlaka

BIBLIOGRAFIJA

SIMBOLI

PAH - policiklični aromatski ogljikovodiki

BP - benzo(a)piren

MPC - največja dovoljena koncentracija

MPC SS - povprečna dnevna največja dovoljena koncentracija

HPLC - tekočinska kromatografija visoke ločljivosti

GC - plinska kromatografija

LC - tekočinska kromatografija

NPC - normalna fazna kromatografija

RPCH - reverzno fazna kromatografija

LLE - tekoče-tekočinska ekstrakcija

OFS - sorbent z reverzno fazo

TLC - tankoplastna kromatografija

UVOD

Policiklični aromatski ogljikovodiki (PAH) spadajo v skupino obstojnih organskih onesnaževal. Imajo izrazite rakotvorne lastnosti. Eden najnevarnejših predstavnikov PAH je benzo(a)piren (BP).

Benz (a) piren je bil odkrit leta 1933, kasneje, leta 1935, so bile izvedene študije, ki so potrdile njegovo rakotvornost. Danes je benzo(a)piren uvrščen med rakotvorne snovi 1. razreda nevarnosti. Ima mutagene lastnosti. Tudi majhna koncentracija BP negativno vpliva na človeško telo. Koncentracija BP v zraku, ki presega najvišjo dovoljeno koncentracijo (MAC), ob dolgotrajni izpostavljenosti lahko povzroči pljučnega raka. Zato je problem njegovega odkrivanja in opredelitve akuten. Na podlagi njegovih fizikalno-kemijskih lastnosti je bilo razvitih več podobnih metod za njegovo določanje, ki se razlikujejo le v stopnjah vzorčenja in priprave vzorca. Namen mojega dela je bil seznaniti se z lastnostmi PAH in BP, preučiti metode za ločevanje PAH in metode za določanje BP.

1. PREGLED LITERATURE

1.1 Policiklični aromatski ogljikovodiki (PAH)

1.1.1 Splošne informacije

PAH so visokomolekularne organske spojine benzenskega niza, ki štejejo več kot 200 predstavnikov. Vsebujejo od 2 do 7 benzenskih obročev. PAH so široko razširjeni v naravi in ​​so sčasoma stabilni. Imajo rakotvorno in mutageno delovanje. Zaradi svoje toksičnosti in rakotvornosti jih uvrščamo med prednostna onesnaževala. Določanje PAH se uporablja v ekoloških in geokemičnih študijah. Najbolj strupeni med njimi sta 3,4-benz(a)piren in 1,12-benzperilen, ki ju še posebej pogosto najdemo v okoljskih predmetih.

1.1.2 Izvor PAH

PAH so nezaželen stranski produkt izgorevanja fosilnih goriv. V naravi nastajajo zaradi abiogenih procesov. Vsako leto v biosfero vstopi na tisoče ton PAH, ki se sproščajo iz humusnih komponent tal. Toda večina teh rakotvornih snovi izvira iz umetnih procesov.

Premog velja za mešanico ogromne količine polikondenziranih aromatskih benzenskih jeder z minimalno vsebnostjo vodika. Pri sežigu teh snovi v pečeh, elektrarnah, motorjih z notranjim izgorevanjem te spojine razpadejo. Pri nizkih temperaturah zgorevanja in nezadostni oskrbi s kisikom iz zraka nastanejo reaktivni acetilen in alifatski ogljikovodiki. Acetilen polimerizira v butadien, ki nato tvori jedro aromatskega ogljikovodika. Ko jih dodamo obstoječim aromatskim jedrom, nastanejo PAH.

Pri nepopolnem zgorevanju nastajajo delci ogljika – saje. PAH se adsorbirajo na njegovi površini in vstopijo v okolje.

1.1.3 Fizikalne in kemijske lastnosti PAH

Večina PAH je kristalnih spojin (z izjemo nekaterih derivatov naftalena) z visokim tališčem. PAH so slabo topni v vodi. Pri prehodu na organska topila se njihova topnost poveča in je odvisna od njihove molekulske mase. Praviloma se s povečanjem števila aromatskih obročev in alkilnih radikalov topnost PAH zmanjša.

Večina PAH intenzivno absorbira UV-sevanje (300–420 nm) in v atmosferi hitro fotooksidira v kinone in karbonilne spojine.

1.1.4 Biološko delovanje

PAH vstopajo v telo skozi dihala, kožo ali prebavni trakt.

Vrsta interakcije PAH s telesom je odvisna predvsem od samega ogljikovodika. V bistvu, ko PAH vstopijo v telo, encimi tvorijo epoksi spojino, ki reagira z gvaninom, kar moti sintezo DNA, povzroča motnje ali vodi do mutacij, ki prispevajo k razvoju raka.

Eden najbolj strupenih PAH, kot smo že omenili, je BP. Poleg tega je rakotvorna aktivnost PAH 70-80% zaradi vpliva BP. Zato lahko prisotnost BP v živilih uporabimo za presojo prisotnosti drugih PAH.

1.1.5 Benz(a)piren. splošne značilnosti

Benz (a) piren (C 20 H 12) je kemična spojina, predstavnik družine policikličnih ogljikovodikov (slika 1.1), snov prvega razreda nevarnosti. Nastaja pri zgorevanju ogljikovodikov tekočih, trdnih in plinastih goriv (v manjši meri pri zgorevanju plinastih goriv).

Slika 1.1 Strukturna formula benzo(a)pirena.

BP so rumene plošče ali iglice. Je zelo topen v nepolarnih topilih, na primer v toluenu, benzenu, ksilenu. V polarnih topilih je nekoliko manj topen, v vodi pa praktično netopen.

BP se kopiči predvsem v tleh, manj pogosto v vodi. Iz tal vstopi v rastline in se nadaljuje po trofični verigi. Na vsaki naslednji stopnji se vsebnost benzo(a)pirena poveča za red velikosti.

BP je tipičen kemični karcinogen in je človeku nevaren že v minimalnih koncentracijah, saj ima lastnost kopičenja v človeškem telesu. MDK benzo(a)pirena v različnih objektih je predstavljena v tabeli 1.1. Poleg tega ima BP mutagene lastnosti, tj. lahko povzroči mutacije.

Tabela 1.1 MDK benzo(a)pirena v različnih okoljih

Ime predmeta

MAK, mcg/kg

prekajeni izdelki

Žita

Pitna voda

Vodni rezervoarji

V zraku je povprečna najvišja dnevna dovoljena koncentracija (MPC CC) 0,1 µg/100m 3 .

1.2 Metode za določanje benzo(a)pirena

Glavni metodi za določanje PAH sta tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) z reverzno fazo s fluorimetrično ali spektroskopsko detekcijo in plinska kromatografija (GC) z masno selektivno detekcijo, detekcijo s plamensko ionizacijo, zajemom elektronov ali fotoionizacijo.

Za določitev BP se uporablja tudi metoda luminiscenčne spektroskopije, ki temelji na učinku Shpolskega. Bistvo učinka je v tem, da pri nizkih temperaturah nekatere poliatomske molekule dajejo kvazilinearne spektre luminiscence visoke ločljivosti. Prednost te metode so nizke zahteve glede stopnje čiščenja in občutljivosti. Toda zapletenost strojne opreme je pomembna omejitev za definicijo BP.

Kromatografija je metoda ločevanja, analize in fizikalno-kemijskih študij snovi, ki temelji na gibanju cone snovi vzdolž plasti sorbenta v toku mobilne faze z večkratnimi ponovitvami sorpcijskih in desorpcijskih dejanj. Do ločitve pride zaradi razlike v konstantah porazdelitve posameznih snovi med obema fazama. Najpomembnejša značilnost kromatografije je dinamična narava procesa, pri kateri pride do gradientov koncentracijske porazdelitve molekul ali delcev.

Splošna shema ločevanja komponent zmesi je prikazana na sliki 1.2.

Slika 1.2 Shema izvedbe kromatografskega procesa

Prednosti kromatografskih metod vključujejo možnost hkratnega izvajanja velikega števila parametrov, ki označujejo ločevanje, identifikacijo in kvantifikacijo komponent v mešanici. Tako je kromatografija večkanalni vir informacij.

Kromatografske metode delimo glede na agregacijsko stanje mobilne faze na plinsko in tekočinsko kromatografijo.

Plinska kromatografija pa glede na stanje agregacije stacionarnega (stacionarnega) vključuje plinsko-tekočinsko in plinsko-trdnofazno kromatografijo.

Tekočinsko kromatografijo delimo na tekočino-tekočo, tekočino-trdno fazo in tekočino-gel.

1.2.1 Plinska kromatografija

GC je vrsta kromatografije, pri kateri je mobilna faza v stanju plina ali pare – inertnega plina. Je nosilni plin. Stacionarna faza je tekočina z visoko molekulsko maso, ki je pritrjena na poroznem nosilcu ali na stenah dolge kapilarne cevke.

GC je univerzalna metoda za ločevanje zmesi snovi, ki izhlapevajo brez razgradnje. Komponente zmesi se premikajo skozi kromatografsko kolono z nosilnim plinom. V tem primeru se mešanica večkrat porazdeli med nosilni plin in stacionarno fazo. Do ločitve pride zaradi različne topnosti sestavin zmesi v trdni fazi. Ob izstopu snovi iz kolone se zapišejo z detektorjem.

Detektor je neprekinjena naprava, ki registrira analitični signal. Za GC je bilo predlaganih približno 60 vrst detekcijskih sistemov. Tabela 1.2 navaja vrste detektorjev, ki se najpogosteje uporabljajo v GC.

Tabela 1.2 Detektorji plinske kromatografije

Ime detektorja

Načelo delovanja

Po toplotni prevodnosti

Zabeleži se razlika v toplotni prevodnosti med analitom in nosilnim plinom

Ime detektorja

Načelo delovanja

Elektronski prijem

Analit zajame toplotne elektrone, ki nastanejo z obsevanjem z β-delci ali visokoenergijskimi elektroni nosilnega plina

UV

Absorpcija UV svetlobe s specifičnim kromoforjem analita

mikrovalovna plazma

Vzbujanje analita v mikrovalovni plazmi in emisija svetlobe pri značilni valovni dolžini elementa, prisotnega v snovi

Plamenska fotometrija

Vzbujanje analita v plamenu in emisija svetlobe glede na vrsto elementa v snovi

Atomski absorpcijski spektrometer

Toplotna atomizacija, ki ji sledi absorpcija svetlobe pri določeni valovni dolžini

Elektrokemija

Absorpcija analiziranih snovi s tokom tekočine in njihova elektrokemijska detekcija v toku

IR spektrometer

Absorpcija svetlobe v IR območju s strani analita

Plamenska ionizacija

Nastajanje in registracija ionov v plamenu pri gorenju analiziranih snovi

Masni spektrometer

Tvorba molekularnih in drobnih ionov z udarom elektronov ali kemično ionizacijo

fotoionizacija

Fotokemična tvorba in registracija ionov pod delovanjem močnega UV sevanja na analit

Plamensko ionizacijski detektor je občutljiv, vendar neselektiven za BP. Zato se uporablja samo za analizo preprostih mešanic.

Detektor za zajem elektronov je občutljiv in selektiven za BP, vendar je njegova uporaba težavna zaradi visokega odziva na elektrofilne spojine.

Uporaba fotoionizacije je obetavna za določanje BP, vendar ni našla široke distribucije zaradi nestabilnosti delovanja in visokih stroškov opreme.

GC z masno spektrometrično detekcijo je najboljša rešitev za določanje benzapirena v kompleksnih mešanicah

Načelo delovanja masnega spektrometra je porazdelitev fragmentov ali ionov po masi. Postopek ionizacije se uporablja za pretvorbo nevtralnih molekul v ione. Elektronski udar se najpogosteje uporablja za ionizacijo organskih spojin. Poleg tega se uporablja kemična ionizacija, ki temelji na pojavu ionsko-molekularnih reakcij. Za preučevanje bioloških molekul, polimerov in drugih snovi, ki jih ni mogoče prenesti v plinsko fazo brez razgradnje, se uporabljajo posebne vrste ionizacije.

GC z masno spektroskopsko detekcijo je edina metoda, ki omogoča uporabo internih standardov za kvantitativne določitve. Kot standardne snovi se uporabljajo označene 2 H in 13 C izomerne mešanice PAH. Premik teže in dejstvo, da imajo referenčne snovi skoraj enake lastnosti kot neoznačeni PAH, olajšata identifikacijo.

Ena manjših pomanjkljivosti masnih spektrometrov je majhno območje linearnosti odziva detektorja. Zato je konvencionalni masni spektrometer nadomeščen s časovnim. Njegova značilnost je, da je v kratkem času mogoče dobiti celoten masni spekter spojin in natančno meritev mase do 0,0001 a.m.u.

Kombinacija masnega spektrometra s časovnim preletom in plinsko kromatografijo zagotavlja dobro ločevanje komponent kompleksnih zmesi in nizke meje zaznavnosti.

1.2.2 Tekočinska kromatografija

Tekočinska kromatografija (LC) je metoda za ločevanje in analizo kompleksnih snovi, pri kateri tekočina služi kot mobilna faza. Po eni strani mobilna faza opravlja transportno funkcijo, tj. prenaša nesorbbilno snov, na drugi strani pa uravnava ravnotežne konstante in posledično zadrževanje kot rezultat interakcije s stacionarno fazo in z molekulami snovi, ki se ločujejo.

V LC ločitve najpogosteje potekajo pri sobni temperaturi. Analiziran vzorec se vbrizga v kolono in skozenj se spusti eluent. Pri LC je narava mobilne faze bistvena. Zaradi tega različne kombinacije že majhnega števila stacionarne faze in velikega števila mobilne faze omogočajo reševanje različnih analitičnih problemov.

Analiza pri klasični tekočinski kromatografiji se izvaja dolgo časa, saj je hitrost dovajanja vzorca majhna. Ta metoda je primerna za predhodno ločevanje sestavin zmesi. V večini primerov se uporablja HPLC. Hiter prenos mase z visoko učinkovitostjo ločevanja omogoča HPLC za določanje molekul, makromolekul in ionov. Razlike med klasično LC in HPLC so prikazane v tabeli 1.3.

Tabela 1.3 Eksperimentalne razlike med klasičnim in visokozmogljivim LC

Značilno

Klasični LC

HPLC

Tlak, atm

Iz frakcij atm. do 2 atm.

Hitrost pretoka, mm/min

Trajanje ločitve

Od nekaj ur do nekaj dni

Nekaj ​​minut do nekaj ur

Oprema

Zvočnik in dodatki

Kromatograf

Vrsta ločevanja

Preparativno ločevanje

Analitični oddelek

Odkrivanje

Odkrivanje posameznika

frakcije z analiznimi metodami

Z detektorjem

Količina preskusne snovi

Od nekaj mikrogramov do nekaj kg

Nekaj ​​ng do nekaj mikrogramov

HPLC je metoda kolonske kromatografije, pri kateri je mobilna faza tekočina, ki se giblje skozi kromatografsko kolono, napolnjeno s stacionarno fazo (sorbentom). Za kolone za HPLC je značilen visok hidravlični upor na vstopu.

Glede na mehanizem ločevanja snovi ločimo naslednje možnosti HPLC:

a) distribucija;

b) ionska izmenjava;

c) izključno;

d) kiralni;

e) adsorpcija.

Porazdelitvena kromatografija temelji na porazdelitvi snovi med dvema tekočinama, ki se ne mešata, podobno kot ponavljajoča se ekstrakcija. Pri prehodu tekoče mobilne faze pride do ločitve zaradi različne topnosti sestavin zmesi v tekoči stacionarni fazi.

Pri ionsko izmenjevalni kromatografiji se molekule mešanice snovi, ki so v raztopini disociirane na katione in anione, med premikanjem skozi sorbent ločijo zaradi različne moči interakcije med določenimi ioni in ionskimi skupinami sorbenta.

Pri velikostni izključitveni kromatografiji se molekule snovi ločijo po velikosti zaradi njihove različne sposobnosti prodiranja v pore stacionarne faze. V tem primeru največje molekule, ki lahko prodrejo v minimalno število por stacionarne faze, prve zapustijo kolono, snovi z majhnimi molekulskimi velikostmi pa zadnje.

Pri kiralni kromatografiji optično aktivne spojine ločimo na posamezne enantiomere (zrcalne izomere).

Pri adsorpcijski kromatografiji snovi ločujemo zaradi njihove različne sposobnosti adsorpcije in desorpcije s površine sorbenta z razvito površino.

Glede na polarnost mobilne in stacionarne faze delimo adsorpcijsko kromatografijo na normalno fazno (NPC) in reverzno fazno (RPC) kromatografijo.

NPC uporablja polarni adsorbent in nepolarno mobilno fazo, medtem ko RPC uporablja nepolarni adsorbent in polarno mobilno fazo.

Čeprav je tekočinska kromatografija metoda ločevanja vzorca na komponente, sodoben tekočinski kromatograf ne vključuje samo ločevalnega sistema, ampak tudi sistem za kvantitativno merjenje vsebnosti posamezne komponente, t.j. sistem zaznavanja. Shema kromatografa je prikazana na sliki 1.3.

benzapiren tekočinska kromatografija ogljikovodik

Slika 1.3 Shema tekočinskega kromatografa

1 - črpalka za dovajanje mobilne faze skozi kolono

2 - razpršilnik za vnos vzorca v kolono

3 - ločilni stolpec

4 - detektor - naprava za pridobivanje analitičnega signala

5 - sistem za obdelavo - analitični pretvornik signalov v obliko, primerno za človeško zaznavanje

Za registracijo analitičnega signala, kot smo že omenili, se uporabljajo detektorji. V LC se uporabljajo različne metode odkrivanja. Nekateri od njih so obravnavani v tabeli 1.4.

Tabela 1.4 Detektorji v tekočinski kromatografiji

Ime detektorja

Načelo delovanja

Spektrofotometrična

Med postopkom eluiranja se izmeri optična gostota eluata pri določeni valovni dolžini

Fluorimetrična

Fluorescentno sevanje absorbira

Ime detektorja

Načelo delovanja

Refraktometrija

Določitev koncentracije snovi glede na lomni količnik, ki se razlikuje od lomnega količnika mobilne faze

Evaporativni laserski detektor svetlobe

Načelo delovanja temelji na razliki v parnem tlaku kromatografskih topil, ki sestavljajo mobilno fazo, in analiziranih snovi.

Pri HPLC se za določanje BP uporablja fluorimetrični detektor, ki je selektiven glede na benzapiren in ima visoko občutljivost. Princip delovanja takega detektorja temelji na merjenju fluorescentne emisije absorbirane svetlobe. Meritve potekajo predvsem v UV območju pri valovni dolžini največje absorpcije za določeno skupino snovi. Valovna dolžina fluorescentnega sevanja je vedno večja od valovne dolžine absorbirane svetlobe. Ker se detekcija izvaja od ničelne jakosti, so fluorimetrični detektorji občutljivejši od absorpcijskih detektorjev.

Kombinacija HPLC z masnim spektroskopskim detektorjem ni bila uporabljena pri določanju benzapirena. To je posledica dejstva, da so visoke zahteve za čistost ekstraktov, tj. trajanje analize se poveča zaradi zahtevne priprave vzorca. Poleg tega je oprema precej draga ter premalo selektivna in občutljiva.

1.3 Določanje benz(a)pirena v vodi s HPLC

1.3.1 Merilni instrumenti, pomožna oprema, reagenti

Za meritve se uporablja kromatograf Agilent 1200 HPLC (sl. 1.4) s fluorimetričnim detektorjem, ki zagotavlja vzbujevalno območje valovnih dolžin v območju 270-365 nm in registracijo fluorescence v območju 390-460 nm.

Slika 1.4 Agilent 1200 HPLC

Kromatografsko kolono napolnimo s sorbentom za OFC. V pogojih eksperimenta mora biti učinkovitost kolone vsaj 5000 teoretičnih plošč.

Za pripravo vzorcev uporabimo lij ločnik s prostornino 2000 cm 3, rotacijski uparjalnik, vodno kopel, črpalko z vodnim curkom, n-heksan, natrijev klorid in sulfat ter acetonitril.

Za pripravo umeritvenih raztopin se uporabljajo bučke s prostornino 25 in 50 cm 3 in merilne pipete s prostornino 1, 2, 5 cm 3, raztopina benz(a)pirena s koncentracijo c = 1,0 μg/cm 3 in uporablja se acetonitril.

1.3.2 Priprava vzorca

Ekstrakcija tekočina-tekočina (LLE) se uporablja za ekstrakcijo benzo(a)pirena iz vode. Ekstrahirajte benzo(a)piren z n-heksanom. V ta namen v lij ločnik s prostornino 2000 cm 3 vlijemo izbrano vodo s prostornino 1000 cm 3 in 25-30 cm 3 n-heksana ter 20 cm 3 natrijevega klorida (NaCl) s koncentracijo c=0, dodamo 25 g/cm 3 in izvedemo ekstrakcijo, mešanico stresamo 10-15 minut. Nato vodno plast ločimo in ekstrahiramo še dvakrat brez dodajanja NaCl. Ko se ekstrakti združijo in posušijo, gredo skozi sušilno sredstvo, ki je lij s plastjo natrijevega sulfata, visoko vsaj 2 cm, kot ekstrakcijo lahko uporabimo diklorometan enakega volumna kot n-heksan.

Po ekstrakciji ekstrakt uparimo do prostornine 3 - 5 cm 3 na rotacijskem uparjalniku - napravi za hitro odstranjevanje tekočin z destilacijo pod znižanim tlakom. Ostanek prenesemo v epruveto s prostornino 10 - 15 cm 3 in dodamo n-heksan, nakar raztopino uparimo do suhega v vakuumu črpalke z vodnim curkom, pri čemer epruveto postavimo v vodno kopel pri temperaturo 40-50 °C. Ostanek raztopimo v 0,2-0,5 cm3 acetonitrila. Nastali koncentrat hranimo vsaj 15 minut.

1.3.3 Diplomiranje

Gradacija se izvaja po 5 standardnih raztopinah s koncentracijo 0,002; 0,01; 0,02; 0,05 in 0,1 µg/cm3. Priprava raztopin za umerjanje je opisana v tabeli 1.5.

Tabela 1.5 Priprava raztopin za umerjanje

s, µg/cm3

c0, µg/cm3

Raztopine dopolnimo z acetonitrilom do oznake.

Za vsako od raztopin se posnameta vsaj dva kromatograma. Slika 1.5 prikazuje kromatogram benzo(a)pirena s koncentracijo 0,002 µg/cm 3 .

Slika 1.5 Kromatogram benz (a) pirena s koncentracijo 0,002 μg / cm 3

Razlika med dobljenimi površinami ne sme biti večja od 7 % njihove aritmetične sredine.

Na podlagi dobljenih podatkov se zgradi umeritveni graf (slika 1.6) v obliki odvisnosti površine vrha od masne koncentracije. Kalibracijska krivulja mora biti linearna. Za vsako raztopino odstopanje masne koncentracije, izmerjene po kalibracijski karakteristiki, od navedene vrednosti ne sme presegati 12 %. Če odstopanje preseže navedeno vrednost, se kalibracija ponovi. Kalibracija se izvaja ne samo pred meritvami, ampak tudi po zamenjavi kolone ali med vzdrževalnimi deli kromatografa.

Slika 1.6 Umeritvena odvisnost površine vrha od koncentracije benzo(a)pirena (r 2 = 0,998)

1.3.4 Izvajanje analize HPLC

Kromatografsko določanje benzapirena se izvaja v koloni HPLC Agilent 1200, učinkovitost kolone mora biti vsaj 5000 teoretičnih plošč na podlagi vrha benzapirena. Notranji premer stebra je 2 mm. Kolona je napolnjena s sorbentom z reverzno fazo (RPS). V tej definiciji je bil uporabljen predstolpec, ki opravlja zaščitno funkcijo. Notranji premer predkolone je 2 mm, polnjena je z enakim OFS.

Kot OFS se uporabljajo sorbenti z vezanimi fazami, pridobljeni na osnovi silikagela. V tej definiciji sta bila kot sorbenta uporabljena oktadecil silikagel (C 18) z velikostjo delcev 5 μm in hidrofobni mikroporozni hiperzamreženi polistiren s premerom delcev 3,2 μm in povprečnim premerom por 20–40 E. Ta sorbent je kemično stabilen. pri pH = 2–7. Učinkovitost ločevanja je zagotovljena z visoko površino delcev sorbenta, enakomernostjo sestave sorbenta in gosto enotno embalažo. Kapacitetni faktor (k) takega sorbenta je 9,86.

Mobilna faza je zmes acetonitril - voda. Pripravite eluent v volumskem razmerju 8:2. V stekleno posodo s prostornino 1000 cm 3 dodamo 200 cm 3 vode in z acetonitrilom dovedemo do oznake. Neposredno pred uporabo eluent pustimo za razplinjevanje vsaj 4 ure. Za hitrejše razplinjevanje posodo z eluentom izpraznimo tako, da jo priključimo na vodno črpalko in postavimo v ultrazvočno kopel. Eluent dovaja zančni dozirni ventil (injektor) z volumnom zanke 10 mm 3, pretok mobilne faze je 200 mm 3 /min.

Pri teh pogojih kromatografija traja 20-30 minut.

1.3.5 Registracija in obdelava rezultatov

Benzopiren se detektira s fluorescenčnim detektorjem. Priporočljivo je registrirati kromatogram pri valovni dolžini vzbujanja l ex = 365 nm in registrirati valovno dolžino registracije l. = 400 - 460 nm.

Za povečanje občutljivosti v tej tehniki so bile programirane valovne dolžine vzbujanja in emisije s fluorescenco. Način programiranja je prikazan v tabeli 1. 6.

Tabela 1.6 Način programiranja pri uporabi fluorescentnega detektorja

Kromatogram, dobljen z analizo vode, je prikazan na sliki 1.7.

Slika 1.7 Kromatogram vsebnosti BP v vodi

Vrh benzapirena je določen z retenzijskim časom, ker je to kvalitativna značilnost benzo(a)pirena. Za količinsko opredelitev vsebnosti benzo(a)pirena se izračuna površina vrha. Nato se glede na kalibracijski graf ugotovi njegova koncentracija.

Če koncentracija benzo(a)pirena presega največjo koncentracijo standardne raztopine, se analizirana raztopina razredči in vzorec ponovno analizira.

Občutljivost določanja benzapirena s to metodo je 0,01 µg/DM 3 .

1.4 Določanje benz(a)pirena v vodi z GC

1.4.1 Vzorčenje in priprava

Pomemben del analize je izbira in priprava vzorca. Voda se vzame večkrat z intervalom nekaj dni. Po tem se voda filtrira in vzame vzorec 0,5 litra. Vzorcu dodamo natrijev klorid in ga shranimo v hladilniku največ en dan.

Za pridobitev zanesljivih podatkov se BP ekstrahira iz vzorca z metodo LLE. Ekstraktant je dietileter. Ekstrakcija se izvede trikrat. Prva dva krat se snov ekstrahira v prostornini 50 ml ekstrakta. Tretjič je prostornina ekstragenta 30 ml. Vse ekstrakte združimo in uparimo v rotacijskem uparjalniku, dokler ni popolnoma odstranjen eter. Nastali vzorec raztopimo v 2 ml benzena.

Pred kvantitativnim določanjem BP komponente zmesi ločimo s tankoplastno kromatografijo (TLC).

TLC je kromatografska metoda, ki temelji na uporabi tanke plasti adsorbenta kot stacionarne faze.

Pred separacijo ploščo potopimo v 4% raztopino kofeina v kloroformu in aktiviramo v pečici pri temperaturi 100 °C. Da odstranimo nečistoče s plošče, jo po ohlajanju speremo s kloroformom in ponovno aktiviramo v pečico 30 minut pri temperaturi 100 o S.

Vzorce, raztopljene v benzenu, damo na ploščo in kromatografiramo. Eluter je zmes cikloheksan - n-heksan, v prostorninskem razmerju 16:1.

1.4.2 Kvantifikacija

Kvantitativno analizo po tej metodi izvajamo s plinsko-tekočinsko kromatografijo s plamensko ionizacijskim detektorjem. Za analizo je bil uporabljen kromatograf "Tsvet - 500" (slika 1.8) s plamensko ionizacijskim detektorjem.

Slika 1.8 Plinski kromatograf "Color - 500"

Nosilni plin za to določitev je bil dušik. Dušik smo dovajali s pretokom 3 ml/min. Za analizo smo uporabili kapilarno kremenčevo kolono velikosti 25 m × 0,32 mm. Kot stacionarno fazo smo uporabili metil silikonsko olje OV-101 z debelino filma 0,4 µm. Analiza je potekala v načinu programiranja temperature od 210 do 300 °C s hitrostjo 4 °C/min. 1 μL vzorec smo vbrizgali z mikrobrizgalko.

Slika 1.9 prikazuje kromatogram BP, dobljen s to metodo.

Slika 1.9 Kromatogram BP, pridobljen z GC (3-BP)

Kvalitativno je bil BP določen z retenzijskim časom v primerjavi z retenzijskim časom standardnega vzorca, ki je bil 28 minut.

Kvantitativno se BP določi z metodo zunanjega standarda. Če želite to narediti, zgradite umeritveni graf za več standardnih vzorcev z razponom koncentracije 1–20 ng/ml. Višina vrha je bila uporabljena kot analitični signal.

Benz (a) piren je rakotvorna snov 1. razreda nevarnosti v zvezi s PAH. Najdemo ga v zemlji, vodi, zraku, hrani, ko pride v telo, pa se kopiči. Zato je njegova določitev v različnih objektih prednostna naloga.

MPC za BP je precej nizek, zato se za njegovo določanje uporabljajo občutljive metode. Težavnost njegovega določanja je tudi v tem, da lahko vzorec poleg BP vsebuje tudi njegove izomere, kot sta benz(e)piren in perilen, katerih retencijski čas je skoraj enak kot pri BP. To pomeni, da prisotnost izomerov otežuje identifikacijo snovi. Ta problem se reši tako, da se mešanica najprej loči s TLC, kot tudi z uporabo standardnih vzorcev BP.

V tem tečaju je bilo obravnavanih več kromatografskih metod, ki so primerne za določanje benzo (a) pirena. Po predhodnem delu z literaturo je bila utemeljena izbira metod za njeno kvantitativno določitev. Na podlagi metode so bile izbrane metode in prikazani so kromatogrami, dobljeni s temi metodami.

BIBLIOGRAFIJA

1. Traven VF Organska kemija. Učbenik za univerze: v 3 zvezkih / VF Traven - M .: BINOM. Laboratorij znanja, 2013. --. - T. 2. - 2013. - 517 str.

2. Grechishcheva N. Yu. Interakcija huminskih kislin s polinuklearnimi aromatskimi ogljikovodiki: kemijski in toksikološki vidiki: disertacija ... za diplomo doktorja kemije. Znanosti: 02.00.13 / N. Yu. Grechishcheva. - M., 2000. - 157 str.

3. Pat. 2466406 Ruska federacija. Metode kvantitativnega določanja benzo (a) pirena v urinu s tekočinsko kromatografijo / Zaitseva N. V., Ulanova T. S., Kornazhitskaya T. D., Kislitsina A. V., Pshenichnikova E. O., Permyakova T. S. - - št. 2011142553/15; dec. 20.10.11; objav. 10.11.12, bik. št. 31.

4. Najvišje dovoljene koncentracije (MPC) kemikalij: GN 2.1.7.2041-06. -- [Predstavljeno 2006-02-07]. - M .: Standardinform, 2006. - 7 str.

5. Tsimbalyuk K. K. Določanje policikličnih aromatskih ogljikovodikov (PAH) v okoljskih objektih (Pregled) / K. K. Tsimbalyuk, Yu. M. Denga, V. P. Antonovich // Metode in predmeti kemijske analize. - 2013. - T. 8, št. 2. - S. 50 - 62.

6. Yu A. Zolotov, Osnove analizne kemije. Splošna vprašanja. Metode ločevanja: v 2 knjigah. / Yu. A. Zolotov, E. N. Dorokhova, V. I. Fadeeva in drugi, ur. Yu. A. Zolotova. -- M.: Višje. Šk., 2002. --. -- Princ. 1. - 2002. - 351 str.

7. Tsarev N. I. Praktična plinska kromatografija. Učni pripomoček za študente Fakultete za kemijo pri posebnem predmetu "analizne metode plinske kromatografije" / N.I. Tsarev, V.I. Tsarev, I.B. Katrakov. - Barnaul.: Založba Altai State University, 2000. - 156 str.

8. Drugov Yu. S. Plinska kromatografska analiza onesnaženega zraka / Yu. S. Drugov, A. A. Rodin. -- M.: BINOM. Laboratorij znanja, 2015. -- 531 str.

9. Styskin E. L. Praktična tekočinska kromatografija visoke ločljivosti / E. L. Styskin, L. B. Itsikson, E. V. Braude. -- M.: Kemija, 1986. -- 210 str.

10. Dmitrikov V. P., Larionov O. G., Nabivach V. M. Analiza policikličnih aromatskih ogljikovodikov s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti // Uspekhi khimii. - 1986. - T. 2, št. 4. - S. 679 -700.

11. Pitna voda. Metoda za določanje vsebnosti benzo(a)pirena: GOST 31860 - 2012. -- [Predstavljeno 2014-01-01]. - M .: Standardinform, 2014. - 11 str. -- (Meddržavni standard).

12. Borsch N. A. Določanje benzapirena s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti / N. A. Borsch, S. V. Sidorenko // Sodobni trendi v razvoju znanosti in tehnologije. - 2016. - V. 1, št. 2. - S.37 - 41.

13. Proskurina N. A. Določanje polinuklearnih aromatskih ogljikovodikov v živilskih izdelkih, ki vsebujejo maščobe, z ekstrakcijo v trdni fazi / N. A. Proskurina, V. A. Davankov, M. M. Ilyin // Sorpcijski in kromatografski procesi. - 2009. - T. 9, št. 2. - S. 167 - 176.

14. Nazarkina S. G. Nazarkina S. G., Purygin P. P., Bulanova A. V., Larionov O. G. Kapilarna plinska kromatografija pri ekološkem nadzoru staljene vode // Vestnik SamGU. - 2000. - T. 2, . -- S. 152 -156.

Gostuje na Allbest.ru

...

Podobni dokumenti

    Aromatski ogljikovodiki: splošne značilnosti. Nomenklatura in izomerija, fizikalne in kemijske lastnosti aromatskih ogljikovodikov. Mehanizem reakcij elektrofilne in nukleofilne substitucije v aromatski seriji. Uporaba arenov, njihova toksičnost.

    povzetek, dodan 11.12.2011

    Splošne informacije o vinil kloridu - brezbarven plin, močan strup, ki ima mutagene, rakotvorne in teratogene učinke. Zgodovina odkritja vinil klorida, njegove kemijske lastnosti in metode pridobivanja. Katalitično hidrokloriranje acetilena v plinski fazi.

    predstavitev, dodana 8.10.2015

    Razvrstitev aldehidov, zgradba, pojavljanje v naravi, biološko delovanje, uporaba. Nomenklatura ketonov, zgodovina odkritja, fizikalne in kemijske lastnosti. Reakcije nukleofilne adicije. Kemijske metode za identifikacijo aldehidov.

    predstavitev, dodana 13.05.2014

    Lastnosti vode in načini njenega mehčanja. Zahteve za trdoto porabljene vode pri proizvodnji toplote in električne energije. Teoretične osnove in metode za določanje trdote vode s kompleksometrično metodo. Vzorčenje, reagenti, določanje.

    seminarska naloga, dodana 10.7.2009

    Pojem in nomenklatura fenolov, njihove osnovne fizikalne in kemijske lastnosti, značilne reakcije. Metode pridobivanja fenolov in obseg njihove praktične uporabe. Toksične lastnosti fenola in narava njegovega negativnega vpliva na človeško telo.

    seminarska naloga, dodana 16.03.2011

    Zgodovina odkritja aspartama, njegove lastnosti. Metoda za določanje aspartama, oprema, instrumenti in reagenti. Aspartam v človeškem telesu. Toksikološke in klinične študije aspartama. Uživanje živil, ki vsebujejo aminokislino fenilalanin.

    povzetek, dodan 04.10.2011

    Toksični učinek fenola in formaldehida na žive organizme, metode za njihovo kvalitativno določanje. Kvantitativno določanje fenola v vzorcih naravnih voda. Metoda za določanje minimalnih detekcijskih koncentracij organskih strupenih snovi v vodi.

    seminarska naloga, dodana 20.05.2013

    Kemična zgradba, lastnosti in biološki pomen vitamina C. Dnevna potreba po njem. Eksperimentalno jodometrično določanje, kvantitativne in kemijske metode za analizo vsebnosti vitaminov v živilih in vitaminskih pripravkih.

    seminarska naloga, dodana 18.03.2013

    Splošne značilnosti in glavne kemijske lastnosti aromatskih acetamino derivatov. Metode za ugotavljanje pristnosti aromatskih acetamino derivatov. Uporaba acetamino derivatov v farmakologiji in njihov učinek na človeško telo.

    seminarska naloga, dodana 11.11.2009

    Skupne lastnosti v strukturi molekul eno- in polihidričnih alkoholov. lastnosti etilnega alkohola. Vpliv alkohola na človeško telo. Vzpostavitev ujemanja med izhodnimi snovmi in reakcijskimi produkti. Kemijske lastnosti polihidričnih alkoholov.


Potrdilo št. 30-08 z dne 03.04.2008
FR.31.1.2008.01033

1. Predmeti študija

Ta merilni postopek se uporablja za prekajeno meso, prekajene ribe in mastne izdelke ter določa določanje masne koncentracije benzo(a)pirena s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti s fluorimetrično detekcijo.

2. Merilno območje

MPC za benz(a)piren v mastnih, prekajenih mesnih, prekajenih ribjih izdelkih je 1 µg/kg.

Metoda zagotavlja pridobivanje rezultatov meritev masne koncentracije benzo(a)pirena v območjih, predstavljenih v tabeli 1.

Tabela 1. Merilna območja masne koncentracije benzo(a)pirena

Tip izdelka razpon mase
koncentracija, mcg/kg		 MPC,
mcg/kg
maščobni izdelki 0,5 – 2,0 1,0
prekajeni mesni izdelki 0,5 – 2,0 1,0
prekajeni ribji izdelki 0,5 – 2,0 1,0

3. Priprava vzorca

Vzorčenje, konzerviranje in shranjevanje vzorcev izdelkov se izvaja v skladu z GOST 7631, GOST 9792, TU in drugo regulativno dokumentacijo, ki ureja vzorčenje za določene vrste izdelkov.

Priprava vzorca je sestavljena iz stopenj vzorčenja (vzorec predhodno ohladimo na temperaturo minus 12-18 °C 30 min), mletja, homogenizacije z brezvodnim natrijevim sulfatom, ekstrakcije homogeniziranega vzorca s heksanom v bučki z ultrazvočna kopel, spontano izločanje trdne oborine (v 1-2 min), razmaščevanje ekstrakta v zamrzovalniku (v valj dodamo silikagel, dodamo ekstrakt, vsebino cilindra postavimo v zamrzovalnik), čiščenje supernatantne heksanske plasti z ekstrakcijo v trdni fazi brez zadrževanja (na kartušah Strata Silica Si-1) *, odstranjevanje eluata v toku zraka ali inertnega plina.

* Opomba. Kadar je koncentracija maščobe prvotnega analiziranega produkta manjša od 5 %, je treba izvirnemu ekstraktu vzorca po zamrzovanju dodati majhno količino eluirnega reagenta - etil acetata (0,1 ml do 6 ml očiščenega ekstrakta).


4. Izvedba kromatografske analize

4.1. Oprema in pogoji za HPLC analizo umeritvenih raztopin benz(a)pirena, pripravljeni vzorci produkta.

Za kromatografsko analizo benzo(a)pirena je treba uporabiti izokratični tekočinski kromatografski sistem visoke ločljivosti s fluorimetrično detekcijo.

Za izvedbo analize predhodno pripravimo umeritvene raztopine iz GRM raztopine benzo(a)pirena v heksanu ali iz GRM raztopine benzo(a)pirena v acetonitrilu (topilo odpihnemo, standardni vzorec ponovno raztopimo v heksanu). ); pripraviti vzorec; pripravite napravo za delovanje.

Oprema:

  • tekočinski kromatograf "Stayer" s fluorimetričnim detektorjem;
  • osebni računalnik z nameščeno programsko opremo "MultiChrome za Windows XP" različice 1.5 ali 2x.
  • izokratski način;
  • kolona: Luna C18(2) 150x3,0 mm 3 µm (Phenomenex, ZDA);
  • zaščitni steber: C18 4x3,0 mm (Phenomenex, ZDA);
  • mobilna faza: raztopina acetonitril/voda (75:25);
  • pretok: 0,3 ml/min;
  • prostornina zanke: 10 μl;
  • temperatura: 50°C;
  • RFU območje: 0,01;
  • detekcija: fluorimetrična (λex: 365±2 nm; λem: 400–460 nm).

    • Umerjanje se izvaja z uporabo umeritvenih raztopin (v celotnem območju določenih koncentracij) vsaj enkrat na dva tedna, pa tudi pri uporabi nove serije reagentov, zamenjavi kolon in po popravilu kromatografa.

    4.2. Določanje kvantitativne vsebnosti benzo(a)pirena v vzorcu produkta.

    Za določitev kvantitativne vsebnosti komponente vzorca produkta (benzo(a)piren) se izvede kromatografska analiza ene izmed umeritvenih raztopin, ki ji sledi kromatografska analiza pripravljenega vzorca. Za zanesljivost meritev se kromatografska analiza tako umeritvene raztopine kot pripravljenega vzorca izvede vsaj 2-krat zaporedoma.

    Z nameščeno programsko opremo - "MultiChrome za Windows XP" v poročilu ali nad vrhom (odvisno od nastavitev možnosti "POGLED") se na koncu meritve samodejno določi rezultat v obliki koncentracije v vzorec, vnesen v kromatograf (vendar ne v začetni vzorec, odvzet za raziskavo!).

    Za pridobitev rezultata je potrebno izvesti vsaj dve vzporedni meritvi (pridobiti dva kromatograma). Rezultat meritve se vzame kot aritmetična sredina vsebnosti benzo(a)pirena v koncentratu analiziranega vzorca C xp, μg/l (izračunana iz dveh vrednosti masne koncentracije benzo(a)pirena v koncentrat analiziranega vzorca C 1 in C 2).
    Masni delež benzo(a)pirena v analiziranem vzorcu (v originalnem vzorcu) X, mcg/kg se izračuna po formuli:

    Kje:
    C xp - povprečna vrednost koncentracije benzo(a)pirena, dobljena s kromatografijo pri dveh vzporednih meritvah [ng/ml];
    V 1 – volumen začetnega ekstrakta, ki je dejansko enak volumnu heksana, odvzetega za primarno ekstrakcijo (50 ml);
    V 2 - prostornina ekstrakta (del izvirnika), vzetega za zamrzovanje (30 ml);
    V 3 je volumen ekstrakta (del ekstrakta po zamrznitvi), vzetega za SPE (6 ml) [ml];
    V 5 je prostornina končnega ekstrakta, katerega del se vnese v kromatograf (približno 3 ml) [ml];
    K vzorčenje - koeficient vzorčenja, ki upošteva delež mase vzorca proizvoda (zmešanega z natrijevim sulfatom), vzetega za ekstrakcijo, glede na skupno maso vzorca, vzetega za analizo. V vseh primerih je enak 0,736;
    K zamrzne je koeficient izgube benzo(a)pirena med zmrzovanjem. Za vse kategorije proučevanih izdelkov je ta koeficient enak in znaša 0,95;
    K dodatno 1 je koeficient primarne tekoče ekstrakcije s heksanom. Za vse kategorije preučevanih izdelkov je enak in enak 0,95;
    K TFEextr.2– koeficient ekstrakcije benzo(a)pirena v trdni fazi, enak 0,95;
    m pr. – prst ali tla, odvzeta v analizo [g].